Метод измерения Вирусный Кинетика Fusion на одном уровне частиц
Summary
Мы представляем<em> В пробирке,</em> Двухцветного анализа флуоресценции для визуализации слияние одиночных частиц вируса с двухслойной жидкости цели. Называя вирусных частиц с флуорофоров, что дифференциально пятно вирусной оболочки и ее интерьер, мы имеем возможность отслеживать кинетику hemifusion и образования пор.
Abstract
Мембранные слияние является важным шагом в процессе вступления оболочечных вирусов в клетки. Обычные анализы слияние обычно сообщают о большом числе слияние событий, что делает ее трудно количественно проанализировать последовательность молекулярной этапов. Мы разработали в пробирке, двухцветные флуоресценцию ряда анализов для мониторинга кинетики одного слияние вирусных частиц с мишенью на двухслойной жидкости существенно поддержки.
Грипп вирусных частиц инкубируют с зеленым липофильных флуорофора запятнать мембраны и красные гидрофильные флуорофора запятнать вирусных интерьера. Мы депозита ганглиозида содержащих липидного бислоя на декстран-functionilized стеклянной поверхности проточной ячейки, инкубировать вирусных частиц на плоских двухслойных и изображения флуоресценции 100 х 100 мкм 2 области, содержащей несколько сотен частиц, на ПЗС камеры. По изображения как красный и зеленый флуоресценции, мы можем одновременно контролировать поведение мембраны красителя (зеленый) и водный контента (красный) частиц.
После снижения рН до значения ниже слияния рН, частицы сливаются с мембраной. Hemifusion, слияние внешнего листовку вирусной мембраны с внешней листовка целевой мембраны, будет видно, как внезапное изменение в зеленой флуоресценции частицы. После последующего слияния двух остающихся дистальных листовки пор будет сформирован и красно-излучающих флуорофора в вирусные частицы будет выпущен под целевой мембраны. Это событие приведет к снижению красной флуоресценции отдельных частиц. Наконец, интегрированная флуоресценции рН-чувствительных флуорофора, внедренного в целевой мембраны отчеты о точном времени рН капли.
Из трех флуоресценцию времени следы, все важные события (рН капли, липидный смешивания на hemifusion, содержание смешивания на порообразования) теперь могут быть извлечены в прямой манере и для каждой частицы в отдельности. Собирая прошедшее время для различных переходов для многих отдельных частиц в гистограммы, можно определить время жизни соответствующих промежуточных продуктов. Даже скрытые промежуточные, которые не имеют прямого флуоресцентного наблюдаемые могут быть визуализированы непосредственно из этих гистограмм.
Protocol
Discussion
Подготовка жидкости и непрерывного поддерживается бислоев липидного может оказаться непростой задачей. Следовые количества загрязняющих материалов или дефекты поверхности будут препятствовать распространению бислоев. Тщательная очистка и осаждение равномерным слоем декстран име…
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке грантов NIH AI57159 (для СЧ) и AI72346 (для AMvO). SCH является Медицинского института Говарда Хьюза следователь.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Corning cover glass squares, 25 mm | Sigma | CLS286525 | ||
| Fused silica slides | Technical Glass | |||
| Staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | ||
| (3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane | Gelest | SIG5840.1 | ||
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | ||
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti | 850375 | ||
| 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti | 850457 | ||
| Cholesterol | Avanti | 700000 | ||
| N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | ||
| Streptavidin, fluorescein conjugate | Invitrogen | S-869 | ||
| Disialoganglioside GD1a from bovine brain | Sigma | G2392 | ||
| Mini Extruder | Avanti | 610000 | ||
| 0.1 micron polycarbonate membrane filters | Whatman | 800309 | ||
| 10 mm drain discs (membrane supports) | Whatman | 230300 | ||
| Sulforhodamine b sodium salt | S1402 | |||
| Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) | See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol | |||
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | ||
| Nikon fluorescence microscope | Nikon | TE2000-U | ||
| Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective | Nikon | |||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser | Coherent | |||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702213 |
References
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
