Método para la medición de la cinética de fusión viral a nivel de partícula
Summary
Se presenta un<em> In vitro,</em> De dos colores ensayo de fluorescencia para visualizar la fusión de las partículas del virus solo con una capa doble objetivo de líquidos. Mediante el etiquetado, las partículas virales con fluoróforos que diferencialmente mancha de la membrana viral y en su interior, somos capaces de controlar la cinética de hemifusion y la formación de poros.
Abstract
La fusión de membranas es un paso esencial en la entrada de los virus envueltos en las células. Ensayos convencionales de fusión suelen informar sobre un gran número de eventos de fusión, por lo que es difícil de analizar cuantitativamente la secuencia de los pasos moleculares que intervienen. Hemos desarrollado una in vitro, de dos colores ensayo de fluorescencia para controlar la cinética del virus de la única fusión de partículas con una doble capa de destino en un soporte esencial líquido.
Partículas virales de la gripe se incuban con un fluoróforo verde lipofílico para teñir la membrana y un fluoróforo rojo hidrófilo para manchar el interior viral. Depositamos una bicapa lipídica que contienen gangliósidos en la superficie del vidrio dextrano functionilized de una celda de flujo, incubar las partículas virales en la bicapa plana y la imagen de la fluorescencia de un 100 x 100 m 2 Superficie, que contiene varios cientos de partículas, en un CCD cámara. Por imágenes tanto de la fluorescencia roja y verde, que al mismo tiempo puede controlar el comportamiento de la membrana de colorante (verde) y el contenido acuoso (rojo) de las partículas.
Al bajar el pH a un valor inferior al pH de fusión, las partículas se fusionan con la membrana. Hemifusion, la fusión de la hoja exterior de la membrana viral con la hoja exterior de la membrana de destino, será visible como un repentino cambio en la fluorescencia verde de una partícula. Tras la posterior fusión de los dos folletos distal restante un poro se formará y el fluoróforo rojo que emiten en la partícula viral se dará a conocer en la membrana blanco. Este acontecimiento dará lugar a una disminución de la fluorescencia de color rojo de las partículas individuales. Finalmente, la fluorescencia de un fluoróforo integrados sensibles al pH que se incrusta en la membrana de destino informa sobre la hora exacta de la caída del pH.
De las tres de fluorescencia a tiempo las huellas, todos los eventos importantes (disminución del pH, mezcla de lípidos en hemifusion, el contenido de la mezcla sobre la formación de poros), ahora se puede extraer de una manera directa y para cada partícula individual. Mediante la recopilación de los tiempos transcurridos para las diversas transiciones de muchas partículas individuales en los histogramas, se puede determinar la vida útil de los productos intermedios correspondientes. Incluso intermedios ocultos que no tienen un observable fluorescentes directos pueden ser visualizados directamente de estos histogramas.
Protocol
Discussion
Preparación de fluido y continuo apoyo bicapa lipídica puede ser un reto. Trazas de contaminación de los defectos de material o superficie prevenir la propagación de bicapas. Su limpieza y deposición de una capa uniforme de dextrano son esenciales.
Imagen prolongada de partículas del virus pueden blanquear los marcadores fluorescentes o hacer que se inactiva. Foto-daño de este tipo es muy conocido en la bio-imágenes y campos de una sola molécula y se cree generalmente que se derivan…
Acknowledgements
El trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones AI57159 (SCH) y AI72346 (a amvo). SCH es un Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Corning cover glass squares, 25 mm | Sigma | CLS286525 | ||
| Fused silica slides | Technical Glass | |||
| Staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | ||
| (3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane | Gelest | SIG5840.1 | ||
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | ||
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti | 850375 | ||
| 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti | 850457 | ||
| Cholesterol | Avanti | 700000 | ||
| N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | ||
| Streptavidin, fluorescein conjugate | Invitrogen | S-869 | ||
| Disialoganglioside GD1a from bovine brain | Sigma | G2392 | ||
| Mini Extruder | Avanti | 610000 | ||
| 0.1 micron polycarbonate membrane filters | Whatman | 800309 | ||
| 10 mm drain discs (membrane supports) | Whatman | 230300 | ||
| Sulforhodamine b sodium salt | S1402 | |||
| Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) | See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol | |||
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | ||
| Nikon fluorescence microscope | Nikon | TE2000-U | ||
| Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective | Nikon | |||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser | Coherent | |||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702213 |
References
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
