Tek Parçacık Düzeyinde Viral Fusion Kinetik Ölçüm yöntemi
Summary
Biz mevcut bir<em> In vitro</em> Iki renkli bir sıvı hedef bilayeri ile tek bir virüs partikülü füzyon görselleştirmek için floresan tahlil. Farklı viral zarı ve iç leke fluorophores viral parçacıkların etiketleme, biz hemifusion ve gözenek oluşumu kinetiği izlemek mümkün.
Abstract
Membran füzyon zarflı virüslerin hücre içine girişi sırasında önemli bir adım. Konvansiyonel füzyon deneyleri genellikle zor ilgili moleküler adımları sırası kantitatif analiz yapma, füzyon olayları çok sayıda rapor. Biz, in vitro bir hedef bilayeri aslında bir sıvı desteği ile tek bir virüs parçacıkları eritme kinetiği izlemek için iki renkli floresan tahlil geliştirdik.
Grip viral parçacıkların, membran ve kırmızı bir hidrofilik fluorofor viral iç leke leke yeşil bir lipofilik fluorofor ile inkübe edilir. Biz bir akış hücresi dekstran-functionilized cam yüzeyinde bir gangliozid içeren çift katlı lipid mevduat, bir CCD parçacıkların yüzlerce içeren, düzlemsel bilayeri ve görüntü 100 x 100 mikron 2 alan floresan viral parçacıkların inkübe kamera. Görüntüleme hem de kırmızı ve yeşil floresan, biz aynı anda membran boya (yeşil) ve sulu içeriği (kırmızı) parçacıkların davranışlarını izlemek.
Füzyon pH altında bir değere pH düşürücü üzerine, partiküllerin membran ile sigorta. Hemifusion, hedef zarının dış broşür ile viral zarının dış broşürün birleştirilmesi, yeşil floresan bir parçacığın ani bir değişim olarak görülebilir. Gözenek kalan iki distal broşür sonraki füzyon üzerine kurulacaktır ve viral partikül kırmızı yayan fluorofor hedef membran altında piyasaya sürülecek. Bu olay bireysel parçacıkların kırmızı floresan bir azalmaya yol açacaktır. Son olarak, hedef membran gömülü olduğu bir pH duyarlı fluorofor entegre floresan pH damla tam zamanı bildirir.
Üç floresan-time izleri, tüm önemli olaylar (pH düşmesi, gözenek oluşumu üzerine karıştırma hemifusion, içerik üzerine karıştırma lipid) kolay bir şekilde ve tek tek her parçacık için ayıklanır. Histogramlar birçok bireysel parçacıklar için çeşitli geçişler için geçen süreleri toplayarak, ilgili ara yaşamlarda belirleyebilirsiniz. Doğrudan bir floresan gözlemlenebilir yoksa bile gizli ara bu histogramlar doğrudan görüntülenebilir.
Protocol
Discussion
Sıvı ve sürekli desteklenen çift katlı lipit katmanını hazırlanması zor olabilir. Malzeme veya yüzey kusurları kirlenmesine neden olan eser miktarda bilayers, yayılmasını önlemek. Dekstran düzgün bir tabaka dikkatli bir temizlik ve birikimi esastır.
Virüs parçacıkları uzun süre görüntüleme floresan etiketleri çamaşır suyu veya inaktif hale gelmesine neden olabilir. Bu tür Foto-hasar ve biyo-görüntüleme ve tek bir molekül alanları bilinir ve genellikle heyec…
Acknowledgements
NIH hibe AI57159 (SCH) ve AI72346 (AMvO) tarafından desteklenmiştir. SCH Howard Hughes Tıp Enstitüsü Araştırmacı.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Corning cover glass squares, 25 mm | Sigma | CLS286525 | ||
| Fused silica slides | Technical Glass | |||
| Staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | ||
| (3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane | Gelest | SIG5840.1 | ||
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | ||
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti | 850375 | ||
| 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti | 850457 | ||
| Cholesterol | Avanti | 700000 | ||
| N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | ||
| Streptavidin, fluorescein conjugate | Invitrogen | S-869 | ||
| Disialoganglioside GD1a from bovine brain | Sigma | G2392 | ||
| Mini Extruder | Avanti | 610000 | ||
| 0.1 micron polycarbonate membrane filters | Whatman | 800309 | ||
| 10 mm drain discs (membrane supports) | Whatman | 230300 | ||
| Sulforhodamine b sodium salt | S1402 | |||
| Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) | See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol | |||
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | ||
| Nikon fluorescence microscope | Nikon | TE2000-U | ||
| Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective | Nikon | |||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser | Coherent | |||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702213 |
References
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
