Lentivirus Produktion

Summary

För att göra lentiviruses, är DNA-vektorer transfekterade i människors 293 celler. Efter skörden och koncentrera supernatanten är virus titer bestäms av fluorescens uttryck med en flödescytometer.

Abstract

RNA-interferens (RNAi) är ett system av geners uttryck i levande celler. I RNAi, gener homologa i ordning för att korta interfererande RNA (siRNA) är tystade på efter transkriptionella tillstånd. Kort hårnål RNA, prekursorer till siRNA, kan uttryckas med hjälp av lentivirus, vilket möjliggör RNAi i en mängd olika celltyper. Lentiviruses, såsom humant immunbristvirus, är kapabla att infektera både dela och icke-delande celler. Vi kommer att beskriva ett förfarande som att paketera lentiviruses. Förpackning syftar till att förbereda behöriga viruset från DNA-vektorer. Lentiviral vektor produktionssystem bygger på en "split" system, där det naturliga virala genomet har delats upp i enskilda hjälpare plasmid konstruktioner. Denna uppdelning av de olika virala element in i fyra separata vektorer minskar risken att skapa en replikering-kapabel virus genom oavsiktlig rekombination av Lentiviral genomet. Här är en vektor som innehåller shRNA av intresse och tre vektorer förpackning (p-VSVG, pRSV, pMDL) övergående transfekterade i människors 293 celler. Efter minst ett 48-timmars inkubationstid, viruset som innehåller supernatanten skördas och koncentrerad. Slutligen är virus titer bestäms av reportern (fluorescerande) uttryck med en flödescytometer.

Protocol

Del 1: transfektion av HEK 293 celler att producera Lentiviruses * 24 timmar innan transfektion, platta 2,5 x 10 6 celler i ett 10 cm skål för en confluency på 50-70% nästa dag. Starta detta protokoll genom att förbereda DNA som ett senare kommer transfektera en celler för att göra virus. Först, späd FuGENE 6 Roche Transfektion reagens, en lipid reagens som gör att cellerna tar upp DNA. I ett 1,5 ml rör, pipett 30μl FuGENE 6 i 600ul serumfritt medium (SFDMEM…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS		Invitrogen
FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG		Roche
Bleach		Clorox
10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes		Falcon	353003
Multichannel pipette		Rainin
Filtered pipette tips		Rainin
1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm)		Eppendorf
Ultracentrifuge tubes		Beckman
Tissue culture incubator at 5% CO2		Coulter
Beckman SW41T.I rotor
Beckman ultracentrifuge		Beckman
Fluorescent microscope		Coulter
FACS Array		Beckman