Lentivirus Produzione

Summary

Per rendere lentivirus, vettori di DNA sono transfettate in 293 cellule umane. Dopo la raccolta e concentrando il surnatante, titolo del virus è determinata dalla espressione fluorescenza con un citometro a flusso.

Abstract

Interferenza dell'RNA (RNAi) è un sistema di silenziamento genico nelle cellule viventi. In RNAi, i geni omologhi in sequenza a breve RNA interferenti (siRNA) sono ridotti al silenzio a livello post-trascrizionale di stato. RNA tornante breve, precursori di siRNA, può essere espressa tramite lentivirus, consentendo RNAi in una varietà di tipi di cellule. Lentivirus, come il virus di immunodeficienza umana, sono in grado di infettare sia che divide e non divisione delle cellule. Ci descrivono una procedura che a lentivirus pacchetto. Imballaggio si riferisce alla preparazione di virus competente da vettori del DNA. Lentivirali sistemi di produzione vettoriali sono basati su un sistema 'split', in cui il genoma virale naturale è stata suddivisa in costrutti individuali plasmide helper. Questa divisione dei diversi elementi virale in quattro vettori separati diminuisce il rischio di creare una replica-virus in grado di ricombinazione casuale del genoma lentivirali. Qui, un vettore contenente i shRNA di interesse e di tre vettori imballaggio (p-VSVG, pRSV, pMDL) sono transitoriamente trasfettate in 293 cellule umane. Dopo almeno un periodo di 48 ore di incubazione, il surnatante contenente virus viene raccolto e concentrato. Infine, titolo del virus è determinata dalla giornalista (fluorescenti), espressione con un citometro a flusso.

Protocol

Parte 1: Transfection di HEK 293 cellule di produrre lentivirus * 24 ore prima della trasfezione, piatto 2,5 X 10 6 celle in un piatto di 10 centimetri per una confluenza del 50-70% il giorno successivo. Avviare questo protocollo preparando il DNA con la quale si verrà poi trasfezione proprio le cellule per fare virus. In primo luogo, diluire FuGENE 6 Transfection Reagent Roche, un reagente lipidi che compongono le cellule prendono il DNA. In un tubo da 1,5 ml, pipetta…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS		Invitrogen
FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG		Roche
Bleach		Clorox
10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes		Falcon	353003
Multichannel pipette		Rainin
Filtered pipette tips		Rainin
1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm)		Eppendorf
Ultracentrifuge tubes		Beckman
Tissue culture incubator at 5% CO2		Coulter
Beckman SW41T.I rotor
Beckman ultracentrifuge		Beckman
Fluorescent microscope		Coulter
FACS Array		Beckman