L'isolement et expansion à grande échelle des cellules adultes humaines Colony Forming progénitrices endothéliales

Summary

Cellules endothéliales progénitrices formant colonie (CPEF) sont un outil prometteur pour étudier l'homéostasie vasculaire et de réparation.^1,2 Cet article présente une nouvelle méthode de sérum animal-libres pour l'isolement et l'expansion de ECFC partir hépariné sang adultes périphérique humain avec des mises en commun lysat plaquettaire humain (pHPL) diminue le risque de la vaccination anti-bovin.

Abstract

Ce document présente une stratégie de rétablissement pour le roman de cellules progénitrices endothéliales formant colonie (CPEF) de l'héparine mais autrement non manipulés pour adultes sang périphérique humain au sein d'une moyenne de 12 jours. Après l'expansion à grande échelle> 1×10 ⁸ CPEF peuvent être obtenus pour d'autres essais. Avantageusement en utilisant pHPL le contact des cellules humaines avec bovin antigènes sériques peut être exclue. Par cytométrie en flux et par immunohistochimie des cellules isolées peuvent être caractérisés comme ECFC et leur fonctionnalité dans vitro pour former des structures vasculaires peuvent être testés dans un essai de Matrigel. De plus, ces cellules peuvent être injectées par voie sous cutanée dans un modèle de souris pour la forme fonctionnelle, des vaisseaux perfusés in vivo. Après l'expansion à long terme et la prolifération cryoconservation, la fonction et la stabilité génomique semblent être préservées ^3,4.

Cet isolement des animaux en protéines libres et méthode d'expansion est facilement applicable à générer une grande quantité de CPEF.

Protocol

A.) ECFC ISOLATON JOUR 1: Avant de commencer avec l'expérience de préparer la croissance milieu de culture cellulaire endothéliale moyenne-2 (EGM-2). Supplément 500ml endothéliale Basal Medium-2 avec de l'héparine (1ml de 1000 U / ml), solution de 5ml 100x de pénicilline / streptomycine (tous Sigma, St. Louis, MO; www.sigmaaldrich.com ), L-glutamine (2 mM de concentration finale ), et 50 ml commun lysat plaquettaire humain (pH…

Discussion

Cet isolement roman et la méthode d'extension est un processus simple et efficace qui est plus efficace et moins de temps en évitant toute séparation des cellules (pas de gradient de densité nécessaire) et moins coûteux que les techniques conventionnelles. En utilisant de contact pHPL aux antigènes putatifs bovine et xenoimmunization ultérieure est exclue. Pendant la période de la culture des petits caillots peuvent se former, causée par la pHPL. Basé sur notre expérience de ces caillots n'affectent …

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Endothelial basal Medium-2		Lonza		500ml
EGM-2 SingleQuots		Lonza		EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortisone, ascorbic acid
preservative-free Heparin		Biochrom AG		10U/ml per EGM-2
L-Glutamine		Sigma		2mM per EGM-2
Penicillin and Streptomycin		Sigma		100U/mL Penicillin and 100μg/mL Streptomycin per EGM-2
Trypsin/1mM EDTA		Gibco Cell Culture, Invitrogen		7ml for T75 flask 70ml for CF-4
PBS
Four-layered cell factory (CF-4)		Corning
Sterile Funnel		Corning
T75cm2 culture flask (with vented cap)		Corning
6 mL vacutainer tubes (preservative-free sodium heparin)		Becton Dickenson		preloaded with 108 IU/6ml of preservative-free sodium heparin
50ml Falcon tubes		Falcon
5ml Stripetts		Costar
25ml Stripetts		Costar
Squeezer		Costar
0,2 pore size sterile filter		Millipore		2x 500ml per EGM-2