Isolation und großräumige Ausdehnung der erwachsenen Menschen Endothelial Colony Forming Progenitorzellen
Summary
Endothelial koloniebildenden Progenitorzellen (ECFCs) sind ein viel versprechendes Instrument, um vaskuläre Homöostase und Reparatur zu studieren.<sup> 1,2</sup> Dieser Beitrag stellt eine neuartige Tier-serumfreien Verfahren zur Isolierung und Expansion von ECFC aus heparinisiertem erwachsenen menschlichen peripheren Blut mit gepoolten menschlichen Thrombozyten-Lysat (PHPL) vermindert das Risiko von Anti-Rinder-Impfung.
Abstract
Dieser Beitrag stellt eine neuartige Recovery-Strategie für die endotheliale koloniebildenden Progenitorzellen (ECFCs) aus heparinisiertem aber ansonsten unmanipulierten erwachsenen menschlichen peripheren Blut innerhalb einer im Mittel 12 Tage. Nach großräumige Ausdehnung> 1×10 8 ECFCs können für weitere Tests gewonnen werden. Vorteilhaft mit PHPL den Kontakt von menschlichen Zellen mit Rinderserum Antigene ausgeschlossen werden kann. Mittels Durchflusszytometrie und Immunhistochemie die isolierten Zellen können als ECFC und ihre in vitro-Funktionalität zu vaskulären Strukturen bilden können in einer Matrigel-Assay getestet werden charakterisiert werden. Weitere können diese Zellen subkutan in einem Mausmodell injiziert werden, um funktionelle, perfundierten Gefäßen in vivo zu bilden. Nach langfristige Expansion und Kryokonservierung Proliferation, erscheinen Funktion und genomische Stabilität zu erhalten. 3,4
Dieses Tier-Protein-freie Isolierung und Expansion Methode ist leicht anwendbar, um eine große Menge an ECFCs generieren.
Protocol
Discussion
Diese neuartige Isolierung und Expansion Methode ist ein einfaches und effizientes Verfahren, die effizienter und weniger zeitaufwendig, indem es jegliche Zellseparation (keine Dichtegradienten erforderlich) und weniger teuer als herkömmliche Techniken. Durch die Verwendung von PHPL Kontakt zu Rindern Antigene und vermeintlichen späteren xenoimmunization ist ausgeschlossen. Während der Kulturzeit kleine Blutgerinnsel bilden können, die durch die PHPL. Basierend auf unserer Erfahrung diese Blutgerinnsel haben keinen …
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Katharina Schallmoser für die Bereitstellung PHPL und Margaretha Frühwirth und Daniela Thaler für hervorragende technische Unterstützung.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Endothelial basal Medium-2 |
Lonza | 500ml | ||
| EGM-2 SingleQuots | Lonza | EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortisone, ascorbic acid | ||
| preservative-free Heparin |
Biochrom AG | 10U/ml per EGM-2 | ||
| L-Glutamine | Sigma | 2mM per EGM-2 | ||
| Penicillin and Streptomycin |
Sigma | 100U/mL Penicillin and 100μg/mL Streptomycin per EGM-2 |
||
| Trypsin/1mM EDTA | Gibco Cell Culture, Invitrogen |
7ml for T75 flask 70ml for CF-4 |
||
| PBS | ||||
| Four-layered cell factory (CF-4) |
Corning | |||
| Sterile Funnel | Corning | |||
| T75cm2 culture flask (with vented cap) | Corning | |||
| 6 mL vacutainer tubes (preservative-free sodium heparin) |
Becton Dickenson | preloaded with 108 IU/6ml of preservative-free sodium heparin |
||
| 50ml Falcon tubes | Falcon | |||
| 5ml Stripetts | Costar | |||
| 25ml Stripetts | Costar | |||
| Squeezer | Costar | |||
| 0,2 pore size sterile filter |
Millipore | 2x 500ml per EGM-2 |
References
- Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).
- Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum. Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. , (2009).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. , (2008).
