분리 및 성인 인간 내피 콜로니 형성 전구 세포의 대규모 확장
Summary
내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)은 혈관 항상성 및 수리를 공부하는 유망 도구입니다.<sup> 1,2</sup>이 논문은 절연 및 안티 소 예방 접종의 위험이 떨어지면서 풀링된 인간의 혈소판 lysate (pHPL)와 heparinised 성인 인간의 말초 혈액에서 ECFC의 확장을위한 소설 동물 – 혈청 무료 방법을 소개합니다.
Abstract
본 논문은 heparinized에서 내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)에 대한 새로운 복구 전략을 도입하지만, 그렇지 12일의 의미 이내에 성인 인간의 말초 혈액을 unmanipulated. 대규모 확장 후> 1×10 8 ECFCs는 추가적인 테스트를 위해 얻을 수 있습니다. Advantageously pHPL를 사용하여 소 혈청 항원과 인간 세포의 접촉은 제외시킬 수 있습니다. 유동세포계측법 및 immunohistochemistry으로 분리된 세포는 ECFC 및 체외 기능의 구조와 같은 혈관을 형성하는가 matrigel 분석에서 테스트 수있는 특징 수 있습니다. 또한이 세포는 생체내 subcutaneously에 기능, perfused 혈관을 형성하는 마우스 모델에서 주입 수 있습니다. 장기 확장 및 cryopreservation 확산 후, 기능 및 게놈의 안정성은 화석이 보존 되기에 나타납니다. 3,4가
이것은 동물 단백질 무료로 절연 및 확장 방법은 ECFCs 대량를 생성하기 위해 쉽게 적용됩니다.
Protocol
Discussion
이 소설 절연 및 확장 방법이 더 효율적이고 더 적은 시간이 소요 모든 세포 분리합니다 (밀도 기울기가 필요 없습니다)을 피함으로써과 기존 기술보다 비싸 간단하고 효율적인 프로세스입니다. 보빈 항원과 putative 이후 xenoimmunization에 pHPL 연락처를 사용하여 제외됩니다. 문화 기간 동안 작은 혈전이 pHPL에 의한, 양식 수 있습니다. 우리의 경험을 바탕으로 이러한 혈전은 콜로니 형성과 세포 증식?…
Acknowledgements
저자는 훌륭한 기술 지원 pHPL와 Margaretha Frühwirth와 다니엘라 탈러를 제공 박사 Katharina Schallmoser 감사합니다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Endothelial basal Medium-2 |
Lonza | 500ml | ||
| EGM-2 SingleQuots | Lonza | EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortisone, ascorbic acid | ||
| preservative-free Heparin |
Biochrom AG | 10U/ml per EGM-2 | ||
| L-Glutamine | Sigma | 2mM per EGM-2 | ||
| Penicillin and Streptomycin |
Sigma | 100U/mL Penicillin and 100μg/mL Streptomycin per EGM-2 |
||
| Trypsin/1mM EDTA | Gibco Cell Culture, Invitrogen |
7ml for T75 flask 70ml for CF-4 |
||
| PBS | ||||
| Four-layered cell factory (CF-4) |
Corning | |||
| Sterile Funnel | Corning | |||
| T75cm2 culture flask (with vented cap) | Corning | |||
| 6 mL vacutainer tubes (preservative-free sodium heparin) |
Becton Dickenson | preloaded with 108 IU/6ml of preservative-free sodium heparin |
||
| 50ml Falcon tubes | Falcon | |||
| 5ml Stripetts | Costar | |||
| 25ml Stripetts | Costar | |||
| Squeezer | Costar | |||
| 0,2 pore size sterile filter |
Millipore | 2x 500ml per EGM-2 |
References
- Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).
- Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum. Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. , (2009).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. , (2008).
