Выделение и расширение добычи взрослых человеческих эндотелиальных клеток, образующих колонии Прародитель
Summary
Эндотелиальная колониеобразующих клеток-предшественников (ECFCs) являются перспективным инструментом для изучения сосудистого гомеостаза и ремонта.<sup> 1,2</sup> В работе вводится новый животного сыворотки метод выделения и расширения ECFC с гепарином взрослых периферической крови человека с объединенные тромбоцитов человека лизат (pHPL) уменьшение риска против бычьего иммунизации.
Abstract
В данной статье представлена новая стратегия восстановления эндотелия колониеобразующих клеток-предшественников (ECFCs) с гепарином, но в остальном unmanipulated взрослого человека периферической крови в среднем 12 дней. После большого расширения масштабов> 1×10 8 ECFCs могут быть получены для дальнейших испытаний. Преимущественно с помощью pHPL контакта клеток человека с бычьей сыворотки антигены могут быть исключены. По проточной цитометрии и иммуногистохимии изолированных клеток можно охарактеризовать как ECFC и их функциональность в пробирке для формирования сосудистого подобных структур может быть протестирована в анализе Матригель. В дальнейшем эти клетки могут быть подкожно вводили в модель мыши для формирования функциональной, перфузии судов в естественных условиях. После долгосрочного расширения и распространения криоконсервации, функции и геномной стабильности по всей видимости, сохранится. 3,4
Это животное-белковые свободной изоляции и расширения метод легко применимы для создания большого количества ECFCs.
Protocol
Discussion
Эта изоляция романа и расширение метод простой и эффективный процесс, который является более эффективным и менее затратным по времени, избегая любой ячейке разделения (без градиента плотности необходимости) и дешевле, чем традиционные методы. При использовании pHPL контакт с бычьей ант?…
Acknowledgements
Авторы благодарят доктора Катарина Schallmoser за предоставление pHPL и Маргарета Frühwirth и Даниэла Талер за отличную техническую помощь.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Endothelial basal Medium-2 |
Lonza | 500ml | ||
| EGM-2 SingleQuots | Lonza | EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortisone, ascorbic acid | ||
| preservative-free Heparin |
Biochrom AG | 10U/ml per EGM-2 | ||
| L-Glutamine | Sigma | 2mM per EGM-2 | ||
| Penicillin and Streptomycin |
Sigma | 100U/mL Penicillin and 100μg/mL Streptomycin per EGM-2 |
||
| Trypsin/1mM EDTA | Gibco Cell Culture, Invitrogen |
7ml for T75 flask 70ml for CF-4 |
||
| PBS | ||||
| Four-layered cell factory (CF-4) |
Corning | |||
| Sterile Funnel | Corning | |||
| T75cm2 culture flask (with vented cap) | Corning | |||
| 6 mL vacutainer tubes (preservative-free sodium heparin) |
Becton Dickenson | preloaded with 108 IU/6ml of preservative-free sodium heparin |
||
| 50ml Falcon tubes | Falcon | |||
| 5ml Stripetts | Costar | |||
| 25ml Stripetts | Costar | |||
| Squeezer | Costar | |||
| 0,2 pore size sterile filter |
Millipore | 2x 500ml per EGM-2 |
References
- Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).
- Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum. Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. , (2009).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. , (2008).
