Isolering och storskalig expansion av vuxen människa Endothelial kolonibildande progenitorceller
Summary
Endothelial kolonibildande progenitorceller (ECFCs) är ett lovande verktyg för att studera vaskulär homeostas och reparation.<sup> 1,2</sup> Denna uppsats presenterar en ny djur-serum fri metod för isolering och expansion av ECFC från hepariniserad vuxna humant perifert blod med poolade humana trombocyter lysat (pHPL) minskar risken för antibovin immunisering.
Abstract
Denna uppsats presenterar en ny återhämtning strategi för endotelceller kolonibildande progenitorceller (ECFCs) från hepariniserat men annars unmanipulated vuxna humant perifert blod inom ett medelvärde på 12 dagar. Efter storskaliga utbyggnaden> 1×10 8 ECFCs kan erhållas för ytterligare tester. Fördel genom att använda pHPL kontakten av mänskliga celler med bovint serum antigener kan uteslutas. Med flödescytometri och immunhistokemi de isolerade cellerna kan karakteriseras som ECFC och in vitro-funktionalitet för att bilda blodkärl liknande strukturer som kan testas i ett matrigel analys. Ytterligare dessa celler kan subkutant injicerat i en musmodell för att bilda funktionella, perfusion fartyg in vivo. Efter långsiktiga expansion och frysförvaring spridning, funktion och genomisk stabilitet verkar vara bevaras. 3,4
Detta djur-protein utan isolering och expansion metod är lätt att tillämpa för att generera en stor mängd ECFCs.
Protocol
Discussion
Denna nya isolering och expansion metod är en enkel och effektiv process som är mer effektiv och mindre tidskrävande genom att undvika någon cell separation (ingen densitetsgradient behövs) och billigare än konventionella tekniker. Genom att använda pHPL kontakt med nötkreatur antigener och möjliga efterföljande xenoimmunization är utesluten. Under kultur perioden små blodproppar kan bildas, som orsakas av pHPL. Baserat på våra erfarenheter av dessa blodproppar påverkar inte koloni bildning och celltillv?…
Acknowledgements
Författarna tackar Dr Katharina Schallmoser för att ge pHPL och Margaretha Frühwirth och Daniela Thaler för utmärkt tekniskt bistånd.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Endothelial basal Medium-2 |
Lonza | 500ml | ||
| EGM-2 SingleQuots | Lonza | EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortisone, ascorbic acid | ||
| preservative-free Heparin |
Biochrom AG | 10U/ml per EGM-2 | ||
| L-Glutamine | Sigma | 2mM per EGM-2 | ||
| Penicillin and Streptomycin |
Sigma | 100U/mL Penicillin and 100μg/mL Streptomycin per EGM-2 |
||
| Trypsin/1mM EDTA | Gibco Cell Culture, Invitrogen |
7ml for T75 flask 70ml for CF-4 |
||
| PBS | ||||
| Four-layered cell factory (CF-4) |
Corning | |||
| Sterile Funnel | Corning | |||
| T75cm2 culture flask (with vented cap) | Corning | |||
| 6 mL vacutainer tubes (preservative-free sodium heparin) |
Becton Dickenson | preloaded with 108 IU/6ml of preservative-free sodium heparin |
||
| 50ml Falcon tubes | Falcon | |||
| 5ml Stripetts | Costar | |||
| 25ml Stripetts | Costar | |||
| Squeezer | Costar | |||
| 0,2 pore size sterile filter |
Millipore | 2x 500ml per EGM-2 |
References
- Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).
- Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum. Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. , (2009).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. , (2008).
