Eftersom James Thomson et al utvecklat en teknik 1998 för att isolera och odla hES i kultur har frysa celler för senare användning och upptining och expanderande celler från en frusen lager blivit viktiga ingrepp i rutinmässiga hES cellkultur. Eftersom hES celler är mycket känsliga för påfrestningar av frysning och upptining skall särskild omsorg tas. Här kan vi visa den rätta tekniken för att snabbt tina hES celler från flytande kväve lager, plätering dem på musen embryonala feeder celler, och långsamt frysa dem för långtidsförvaring.
Eftersom James Thomson<em> Et al</em> Utvecklat en teknik för 1998 för att isolera och odla hES i kultur har frysa celler för senare användning och upptining och expanderande celler från en frusen lager blivit viktiga ingrepp i rutinmässiga hES cellkultur. Eftersom hES celler är mycket känsliga för påfrestningar av frysning och upptining skall särskild omsorg tas. Här kan vi visa den rätta tekniken för att snabbt tina hES celler från flytande kväve lager, plätering dem på musen embryonala feeder celler, och långsamt frysa dem för långtidsförvaring.
Den medföljande videon demonstrerar en metod för upptining och frysning hES celler. Celler fryses i flytande kväve ska tinas badet så snabbt som möjligt för att få bästa möjliga återhämtning. Kom ihåg att vara mycket försiktig vid pipettering upptining celler: minimera hanteringen av cellerna och pipetten försiktigt. En flaska med hES-celler kan beläggas på antingen en brunn på en 6-brunnar, eller alla brunnar i ett 4-brunnar och omedelbart placeras i inkubatorn. Eftersom odling i fyra separata brunnar minskar risken för att förlora hela kulturen till förorening, och gör det lättare att hitta hES cell kolonier på den mindre ytan är 4-brunnar rekommenderas vid upptining hES celler för första gången.
Den första dagen efter upptining hES celler, kolonier är små och kan vara transparent. Fylla på hES cellkulturens medium varje dag, även om kolonierna inte är uppenbara i mikroskop eftersom det kan ta några dagar i kultur för hES celler att framstå som etablerade kolonier. Det är viktigt att använda en nyligen pläterat lager MEF matare när upptining celler, som kolonier ofta inte nå en lämplig storlek för passaging tills 10 12 dagar efter den tina.
När upptining en låg passage flaska hES celler är det god sed att expandera och frysa extra flaskor för att upprätthålla ett lager av låg passage celler för framtida kultur och experiment. Det är också en bra idé att rutinmässigt frysa alla "extra" friska hES-celler för att upprätthålla frysta lager. De mest framgångsrika tinar och efterföljande kulturer spärrades på hög kvalitet, odifferentierade, aktivt dela hES cell kolonier. hES celler återhämta sig från en frysning mer effektivt om de hanteras varsamt som större cellaggregat. Den slutliga sammanlagda storlek bör vara ungefär lika (eller något större än) storleken på aggregaten klädd efter en rutin passage.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
D-MEM | Invitrogen | 11965-092 | For MEF mediumjavascript:void(0); | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Certified | Invitrogen | 16000-044 | Heat-inactivated For MEF medium |
|
D-MEM/F-12 | Invitrogen | 11330-057 | ||
Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Pre-screen to ensure support of hES cells | |
bFGF | Stemgent | 03-0002 | Use at [4 ng/mL] final | |
Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | ||
L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 mM (100X) Use at [1X] final |
|
PBS | Invitrogen | 14190-250 | Without Ca2+ or Mg2+ | |
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12 | |
Gelatin | Sigma | G1890 | Type A, Porcine | |
DMSO | Sigma | D2560 | For freezing medium | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Defined | HyClone | SH300.70.01 | For freezing medium | |
6-well plates | Nunc | 140675 | For general culture | |
4-well plates | Nunc | 176740 | For thawing | |
5 mL glass pipettes | Fisher | 13-678-27E | Individually wrapped | |
15 mL conical tubes | Corning | 430052 | Polypropylene | |
Cryogenic vials | Nunc | 5000-1020 | 1.5 mL capacity | |
Freezing container | Nalgene | 5100-0001 | “Mr. Frosty” |