Zebrafish दाढ़ की हड्डी का Barbel के अध्ययन के लिए तरीके

Summary

zebrafish दाढ़ की हड्डी का barbel एक कोल का अर्थ बहिर्जनस्तरीय, mesodermal और तंत्रिका शिखा डेरिवेटिव युक्त अंग है. महत्वपूर्ण बात, वयस्क barbel प्रॉक्सिमल विच्छेदन के बाद पुनर्जीवित कर सकते हैं. इस वीडियो दाढ़ की हड्डी का barbel विकास का परिचय और पुनर्जनन प्रेरित के एक शल्य चिकित्सा प्रोटोकॉल, barbel नमूनों के संग्रह एम्बेडिंग, और नीचे की ओर इमेजिंग द्वारा पीछा दर्शाता है.

Abstract

Barbels त्वचा संवेदी मछलियों, reptiles और amphibians में पाया appendages के हैं. zebrafish, Danio rerio, barbels – एक छोटी नाक जोड़ी और एक अब दाढ़ की हड्डी का जोड़ी के दो जोड़े को विकसित करता है . Barbel ऊतक बहिर्जनस्तरीय mesodermal, और तंत्रिका शिखा मूल की कोशिकाओं, त्वचा कोशिकाओं, ग्रंथियों, स्वाद, melanocytes, संचार वाहिकाओं और संवेदी तंत्रिकाओं सहित शामिल हैं. सबसे वयस्क ऊतकों के विपरीत, दाढ़ की हड्डी का barbel ऑप्टिकली स्पष्ट है, हमें जीवन चक्र के दौरान और इन प्रकार के ऊतकों के विकास और रखरखाव कल्पना करने के लिए अनुमति देता है.

यह वीडियो दाढ़ की हड्डी का barbel (लगभग एक महीने बाद निषेचन की शुरुआत) के प्रारंभिक विकास से पता चलता है और एक शल्य चिकित्सा के लिए वयस्क उपांग (> 3 महीने बाद निषेचन) में पुनर्जनन प्रेरित प्रोटोकॉल को दर्शाता है. संक्षेप में, एक anesthetized मछली की बाईं दाढ़ की हड्डी का barbel बाँझ सिर्फ maxilla की दुम किनारे करने के लिए बाहर का संदंश के साथ ऊंचा है. एक ठीक है, बाँझ वसंत कैंची संदंश के खिलाफ तैनात है के लिए इस स्तर पर barbel शाफ्ट में कटौती, विच्छेदन विमान के लिए एक संरचनात्मक मील का पत्थर स्थापित. पुनर्योजी विकास के इस विमान को सम्मान के साथ और contralateral barbel की तुलना में मापा जा सकता है. Barbel ऊतक तेजी से पुन: बनाता है, चोट के 2 हफ्तों के के भीतर अधिक से अधिक regrowth तक पहुँचने.

पुनर्जीवित barbel का विश्लेषण करने के लिए तकनीकों शामिल विदारक और एम्बेडिंग एक मानक डीएनए वैद्युतकणसंचलन जेल के कुओं में barbels के मिलान जोड़े (पुनर्जन्म और नियंत्रण). एंबेडेड नमूनों सुविधा सकल आकारिकी और morphometry के लिए एक stereomicroscope के तहत फोटो खिंचवाने हैं, और पैराफिन ऊतक विज्ञान जैसे बहाव आवेदन करने के लिए पहले सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है, cryosectioning, और / या पूरे माउंट immunohistochemistry. दाढ़ की हड्डी का barbel स्थापित zebrafish की आनुवंशिक संदर्भ में कई प्रकार की कोशिकाओं के पुनर्योजी क्षमता के अध्ययन के लिए vivo में ऊतकों प्रणाली में एक उपन्यास के रूप में इन विधियों.

Protocol

Zebrafish पालन Zebrafish रखे हैं और मानक एक तरीकों के अनुसार पाला. देर से लार्वा अवधि विगत विकास मंच, एक zebrafish के अपने मानक लंबाई (एसएल), ऊपरी होंठ के anteriormost बिंदु से या मिलीमीटर में सीधी रेखा दूरी से दुम फिन (posteriormost hypural प्लेट) के आधार पर मापा जा सकता है 2. लगभग एक महीने के बाद निषेचन (10-12 मिमी SL), नाक और दाढ़ की हड्डी का barbels घ्राण गड्ढ़े के पास और maxillae के पीछे के कोनों पर, क्रमशः के रूप में पारदर्शी उपकला कलियों दिखाई देते हैं. के रूप में zebrafish परिपक्व, barbels संकीर्ण, गलमुच्छा तरह appendages में विस्तार. क्योंकि दाढ़ की हड्डी का barbel (2-3 मिमी) बड़े और हेरफेर करने के लिए आसान है, हमारे प्रोटोकॉल केवल इस विशेष उपांग के लिए लागू होता है, इसी तरह की तकनीक, हालांकि, छोटे नाक barbel अनुकूलित किया जा सकता है. Barbel कतरन वांछित मंच (जैसे, 1.5-2.5 सेमी, SL ~ 3-6 महीने के बाद निषेचन) में 0.015% एमएस 222 में विसर्जन द्वारा वयस्क zebrafish चतनाशून्य करना (3 aminobenzoate एथिल methanesulfonate) सिस्टम पानी में पीएच 7.0 करने के लिए बफर. जब तक तैरना आंदोलनों को रोकने के निरीक्षण और गिल वेंटिलेशन धीमी है और नियमित रूप से हो जाता है. मछली के आकार पर निर्भर करता है, पूरा संज्ञाहरण लगभग 2-5 मिनट लगते हैं. एक मछलीघर fishnet का प्रयोग, एक समय में एक पेट्री डिश में गीला कागज तौलिया का एक जोड़ टुकड़ा 1-3 मछली हस्तांतरण. एक कुंद रंग का उपयोग करना, पूरबी मछली ताकि वे एक दूसरे को और बाएँ पार्श्व पक्ष अप करने के लिए समानांतर हैं. मछली, operculum के लिए पूरे शरीर को कवर (गिल को शामिल किया गया है) की प्रक्रिया के दौरान त्वचा गहरे नाले और नम रखने के दुम भाग पर गीला कागज तौलिया के मोड़ो हिस्सा है. Stereomicroscope तहत पेट्री प्लेट देखें, कम कोण घटना प्रकाश का उपयोग करने के लिए सिर क्षेत्र रोशन. बाईं दाढ़ की हड्डी का barbel, जो maxilla (छवि 1) के पीछे उदर कोने से protrudes के आधार पर ध्यान दें. चित्रा 1. कसकर थोड़ा maxilla के किनारे करने के लिए बाहर का barbel शाफ्ट समझ. Barbel शाफ्ट तरक्की और एक ठीक इत्तला दे दी वसंत बस संदंश के लिए प्रॉक्सिमल कैंची के जबड़े डालें. कैंची स्थिरता के लिए संदंश छुआ जा सकता है. Barbel के शाफ्ट के साथ कैंची के जबड़े स्लाइड जब तक अत्याधुनिक maxilla के किनारे दृष्टिकोण. कैंची बंद barbel शाफ्ट के माध्यम से कटौती. काट barbel, अभी भी संदंश में जकड़ लिया, निर्धारण या आगे प्रेक्षण के लिए हटाया जा सकता है. तुरंत साफ प्रणाली सतही कवक संक्रमण नियंत्रण करने के लिए नीले methylene की एक बूंद पानी युक्त (~ 500 एमएल) के एक छोटे टैंक के लिए मछली हस्तांतरण. मछली रात भर ठीक करने के लिए अनुमति दें. अगली सुबह, मछली पालन प्रणाली वापस. Barbel उत्थान 2 सप्ताह के बाद अधिक से अधिक है. मेल खाने वाले Barbel जोड़े के अग्रवाल एम्बेडिंग उचित इच्छामृत्यु तकनीक द्वारा मछली लीजिए और 4% की 50 एमएल ट्यूब paraformaldehyde फॉस्फेट आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस रात भर खारा (पीबीएस) बफर में ठीक है. लगानेवाला मात्रा ऊतक की मात्रा कम से कम दस गुना होना चाहिए. निर्धारण के बाद, एक अनुमोदित कंटेनर में paraformaldehyde कचरे के निपटान और ऊतक पीबीएस के कई बदलाव में अच्छी तरह कुल्ला. एक 250 एमएल 2% की गिलास फ्लास्क 150 एमएल में तैयार agarose (टी मीटर ~ 37 डिग्री सेल्सियस) आसुत जल में. एक माइक्रोवेव या गर्म थाली के साथ गर्मी, समय – समय पर आंदोलन जब तक पूरी तरह भंग है. एक 50-60 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पिघला हुआ समाधान संतुलित. बफर चैम्बर के पक्ष के खिलाफ दृढ़ता से, एक छोटे से gasketed जेल मोल्ड (~ 100 एमएल जेल मात्रा 10 x 10 सेमी) रखकर एक मानक जेल वैद्युतकणसंचलन रिग इकट्ठे. 2-4 छोटे दांतेदार नमूना कंघी (4 x 1.5 मिमी) जोड़ें. एक स्तर की सतह पर, मोल्ड में पिघल agarose डाल कंघी के आधार कवर बस, बहुत उथले कुओं के गठन. तुरंत बचे हुए agarose वापस गर्म पानी से स्नान में डाल दिया, यह बाद में इस्तेमाल किया जाएगा ऊतक (9-12 चरण) एम्बेड. फ्लास्क में एक लंबे गिलास पाश्चर विंदुक agarose के रूप में एक ही तापमान विंदुक रखने रखो. 20-30 मिनट के लिए कठोर जेल की अनुमति दें. कंघी निकालें, तो जेल बफर कक्ष से कठोर जेल युक्त मोल्ड को हटा दें. मजबूती प्रयोगशाला टेप के साथ जेल आचारण के खुले पक्षों टेप ताकि जेल से बाहर नहीं स्लाइड करता है. यह टेप agarose की सतह पर कई मिलीमीटर का विस्तार इतना है कि अतिरिक्त agarose बाद में जोड़ा जा सकता है (13 चरण) चाहिए. Stereomicroscope के मंच पर जेल मोल्ड स्थिति. एक खाली अच्छी तरह बड़ाई और ध्यान में लाने के किनारों. अच्छी तरह से निकट agarose की सतह पर पानी की एक बूंद या तय barbel नमूनों (जैसे पुनर्जन्म, और नियंत्रण) युक्त बफर विंदुक. Usiएनजी कीट पिन तुला, अच्छी तरह से नमूनों में नम खींचें और उन्हें नीचे धक्का. ओरिएंट barbel शाफ्ट एक दूसरे के समानांतर और अच्छी तरह से विपरीत लंबे किनारों के खिलाफ गठबंधन. सतह तनाव में मदद मिलेगी स्थिति में ऊतक पकड़. जब को एम्बेड करने के लिए तैयार है, ठीक एक विंदुक टिप या एक प्रयोगशाला ऊतक के कोने में अच्छी तरह से अधिक तरल पदार्थ को हटाने का उपयोग करें. इतनी जल्दी काम के रूप में जाने के लिए नहीं ऊतक बाहर सूखी. गर्म कांच पाश्चर विंदुक का प्रयोग, धीरे से नमूनों में और आसपास ताजा पिघला हुआ agarose विंदुक के लिए जगह में barbel ऊतक मुहर. उमड़ाना नहीं है. इससे पहले agarose hardens, कीट पिन के साथ अंतिम मिनट समायोजन करना. एक गिने कागज नमूना लेबल को अच्छी तरह से आगे प्लेस और यह agarose की एक छोटी सी बूंद के साथ सुरक्षित. दोहराएँ नमूनों में से प्रत्येक के लिए अच्छी तरह 6 10 के माध्यम से कदम है. यदि छवि अंशांकन के लिए वांछित एक मुद्रित सुक्ष्ममापी पैमाने (जैसे, के साथ एक कागज का टुकड़ा सम्मिलित http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/) एक अच्छी तरह से खाली तल में . अच्छी तरह से नीचे समतल कागज और यह गर्म agarose के साथ कवर. बाद नमूनों की सभी एम्बेडेड रहे हैं, जेल की सतह अनियमित agarose के कठोर बूंदों के साथ किया जाएगा. एक सपाट सतह पर जेल प्लेस और धीरे अतिरिक्त पिघला agarose में डाल ऊपरी सतह तक एक समान है. Agarose की छोटी राशि के लिए एक चिकनी सतह प्राप्त करने के लिए आवश्यक का उपयोग करें, बहुत ज्यादा agarose प्रेषित प्रकाश फोटोग्राफी अस्पष्ट होगा. इस शीर्ष परत कठोर अनुमति दें. जेल अब प्रत्येक barbel जोड़ी के लिए सकल आकारिकी रिकॉर्ड stereomicroscope के मंच पर फोटो खिंचवाने जा सकता है. छवि अंशांकन एम्बेडेड सुक्ष्ममापी पैमाने photographing के द्वारा प्राप्त की है. पूरे जेल में संग्रहीत हो सकता है गीला कागज तौलिये में लिपटे और कई हफ्तों के लिए 4 ° पर एक प्लास्टिक की थैली में बंद कर सकते हैं. आगे के विश्लेषण के लिए, अगर barbels के मिलान जोड़ी युक्त ब्लॉक जेल के बाहर कटौती कर सकते हैं और एक स्केलपेल या धार के साथ पैराफिन ऊतक विज्ञान के लिए संसाधित या मानक 3,4 विधियों द्वारा cryosectioning. वैकल्पिक रूप से, व्यक्तिगत barbels agarose के बाहर विच्छेदित कर सकते हैं ठीक सुई, पानी में rinsed के साथ, और अन्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों (उदाहरण के लिए, पूरे माउंट immunohistochemistry या confocal माइक्रोस्कोपी) के लिए संसाधित.

Discussion

zebrafish दाढ़ की हड्डी का barbel एक underutilized, zebrafish में कई प्रकार की कोशिकाओं के विकास, रखरखाव और उत्थान के अध्ययन के लिए ऊतक प्रणाली है. हालांकि barbel उपांग कोई मानव अनुरूप है, सेल प्रकार यह होता है अत्यधिक, संरक्षित कर रहे हैं त्वचा, ग्रंथियों, melanocytes, संचार और एक ऑप्टिकली स्पष्ट और anatomically सरल बेलनाकार संरचना में वाहिकाओं नसों का अध्ययन करने के लिए यह संभव बना. अच्छी तरह से अध्ययन किया दुम फिन के लिए इसी प्रकार, barbel ऊतकों को विच्छेदन के द्वारा पुनर्जीवित करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है है. एक संरचनात्मक मील का पत्थर के रूप में maxilla की सीमा का उपयोग, विच्छेदन विमान ठीक रखा जा सकता है, barbel regrowth की माप की सुविधा. एक अनुभवी ऑपरेटर के लिए, प्रत्येक सर्जरी केवल कुछ सेकंड लेता है. वसूली तेजी से है, और हम इतने तक मछली के व्यवहार पर कोई छोटी या लंबी अवधि के प्रभाव का पता चला है. एक दाढ़ की हड्डी का barbel तैरने के साथ Zebrafish खाने, और गैर शल्य नियंत्रण के रूप में नस्ल के रूप में प्रभावी ढंग से, और ऊतक संग्रह के समय तुलनीय अस्तित्व है सर्जरी के बाद 6 महीने. इस सर्जरी के शारीरिक प्रभाव कम हो क्योंकि 1) extraoral स्वाद barbel पर किया कलियों भी मछली उपकला के कई अन्य भागों, होंठ, गाल ^और 5 सिर सहित, पर पाए जाते हैं की भविष्यवाणी की, और 2) फर्क स्वाद पर दिखाई देते हैं regenerating barbel (LeClair एट अल. अप्रकाशित डेटा.) के 72 घंटे के भीतर इस दाढ़ की हड्डी का एक वयस्क हड्डीवाला के संदर्भ के भीतर घाव भरने, revascularization, और reinnervation के अध्ययन के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव प्रणाली barbel बनाता है.

उत्थान की शल्य चिकित्सा शामिल के बाद, barbels morphometric माप और / या तय ऊतक के सूक्ष्म विश्लेषण के लिए अंतराल पर एकत्र किया जा सकता है. सुविधा, दाढ़ की हड्डी का barbel लगभग (2-3 मिमी) लंबाई और एक zebrafish भ्रूण के व्यास (1-200 मिमी), पैराफिन ऊतक विज्ञान सहित कई मानक प्रोटोकॉल, आवेदन की सुविधा, पूरे माउंट immunohistochemistry, और बगल में cryosectioning संकरण. साथ में ले ली, इन सुविधाओं दाढ़ की हड्डी का एक अत्यधिक ऊतकों की मरम्मत और उत्थान के अध्ययन के लिए vivo मॉडल में संभव barbel बनाते हैं.

Materials

Microscope Equipment

A stereo dissecting microscope with transmitted and incident fiber-optic illumination is required for barbel clipping and agar embedding.

Barbel Clipping

• Fish system water
• 2 zebrafish crossing tanks
• MS-222 (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate; Sigma Chemical #E10521-10G)
• sterile 120-mm Petri plate
• wet paper towels
• blunt metal spatula
• Dumont #55 Bio Inox Forceps (Fine Science Tools #11255-20)
• Mini-Vannas spring scissors (Fine Science Tools #15000-00)
• methylene blue antifungal agent (Drs. Foster & Smith #CD-905781)
• small aquarium fishnet

Tissue collection and agar embedding

• 4% paraformaldehyde in 1x phosphate-buffered saline (PF-PBS), aliquoted into 50 mL conical tubes and stored frozen at -20°C until use
• 1x phosphate-buffered saline (pH 7.27-6)
• 250 mL glass flask
• 2% agarose in distilled water
• standard small agarose gel electrophoresis rig (gel size = ~10 cm square)
• small-toothed electrophoresis sample comb (comb size 4 x 1.5 mm)
• warm water bath (50-60°C)
• laboratory tape
• black enameled insect pins, size 000 (Fine Science Tools #26000-25)
• 1-2 pin holders (Fine Science tools #26016-12)
• 9-inch glass Pasteur pipette
• pipette bulb or pump
• laboratory tissue
• small paper labels
• (optional) printed calibration scale
• wet paper towels
• zip-closure plastic bag
• scalpel/razor blade (to cut out agar blocks)