ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Methode voor Mycotoxine Detection

Summary

Een protocol om trichothecenen (mycotoxinen van zorg voor de gezondheid van de mens) met behulp van een nieuw ontwikkelde screening methode gebaseerd op een competitief immunochemische methode en een laatste elektrochemische detectie te detecteren is aangetoond.

Abstract

Immunoassays zijn een goed alternatief voor de duurdere en tijdrovende kwantitatieve HPLC of GC ^{1, 2} methoden voor het screenen detectie van gevaarlijke mycotoxinen in levensmiddelen. In dit protocol laten we zien hoe te fabriceren en te ondervragen een elektrochemische competitieve enzyme linked immunomagnetische assay gebaseerd op het gebruik van magnetische beads als vaste ondersteuning voor de immunochemische keten ³ en gezeefdrukt elektroden sensing platform.

Onze methode heeft tot doel vast te stellen het totale bedrag van de HT-2 en T-2-toxine, mycotoxinen die behoren tot de trichothecenen familie en van groot belang voor de gezondheid van de mens ^4. Het gebruik van een antilichaam kloon met een kruis reactiviteit van 100% naar HT-2 en T-2 maakt het mogelijk om gelijktijdig zowel de toxines te detecteren met een vergelijkbare gevoeligheid ^5.

De eerste stap van onze test is de coating stap waar we HT2-KLH conjugaat toxine immobiliseren op het oppervlak van de magnetische kralen. Na een blokkerende stap die nodig is om niet-specifieke absorptie te voorkomen, de toevoeging van een monoklonaal antilichaam kan de concurrentie tussen de geïmmobiliseerde HT-2 en gratis HT-2 of T-2 aanwezig is in het monster of opgelost in een standaard oplossing.

Aan het einde van de wedstrijd stap, het bedrag van monoklonale antilichaam gekoppeld aan het geïmmobiliseerde HT-2 zullen worden omgekeerd evenredig aan de hoeveelheid gif in de monsteroplossing.

Een secundaire antilichaam gelabeld met alkalische fosfatase (AP) wordt gebruikt om de binding tussen de specifieke antilichaam en het geïmmobiliseerde HT-2 te onthullen. De laatste meting stap wordt uitgevoerd door het droppen van een hoeveelheid van magnetische kraal ophanging, wat overeenkomt met een specifiek monster / standaard oplossing, op het oppervlak van een gezeefdrukte werkende elektrode, magnetische korrels worden geïmmobiliseerd en geconcentreerd door middel van een magneet precies onder de gezeefdrukt elektrode. Na twee minuten incubatie tussen magnetische kralen en een substraat voor AP, is de enzymatische product gedetecteerd door Differential Pulse voltammetrie (DPV) met behulp van een draagbaar instrument (PalmSens) ook in staat om automatisch acht metingen te starten binnen een interval van enkele seconden.

Protocol

1) Het blokkeren van gecoate magnetische Beads: Ga als volgt te gecoate magnetische kralen te blokkeren: Bereid een set van 2 ml Eppendorf buizen; Homogeniseer (schudden, maar niet vortexen) gecoate magnetische kralen (zie de bijlage voor de bereiding van gecoate magnetische korrels) met behulp van het monster draaiende mixer; Onmiddellijk na homogenisering, pipet 10 ul van gecoate magnetische korrels in elk afzonderlijk Eppendorf buizen; Voeg 1 ml mager…

Discussion

Het gebruik van antilichamen als biomoleculaire erkenning probe heeft gezien een wijdverbreide gebruik voor het waarnemen van technologieën; immunochemische detectie methoden, zoals ELISA's en MEIAs, zijn tegenwoordig een van de meest gebruikte platforms en toegepast in veel laboratoria ^7.

Hoewel deze benaderingen uitzonderlijke gevoeligheid en specificiteit, een primaire doelstelling van vele onderzoeksgroepen te bereiken in de afgelopen jaren is het verbeteren en optimalise…

Materials

Reagents

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Potassium chloride	Sigma	P9333
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma	P9791
Disodium hydrogen phosphate	Sigma	S3264
Sodium chloride	Sigma	S3014
MgCl2 anhydrous	Sigma	M8266
DEA (99.5%)	Sigma	31589
HCl 37%	Sigma	320331
H3BO3	Sigma	B6768
Tris[hydroxymethyl]-aminomethane	Sigma	252859
BSA (albumin bovine serum)	Sigma	A4503
NaOH	Sigma	S5881
TWEEN 20	Sigma	P9416
NaN3	Aldrich	71290
1-Naphthyl phosphate disodium salt	Fluka	N7255
Skimmed milk blocking solution – non fat dry milk	Bio-Rad	170-6404
HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), stock solution (1 mg/ml in PBS):	Biopure	004050	The HT-2-KLH conjugate was obtained by CDI-method where the free OH-groups on position 3 and 4 at the HT-2 toxin were activated by N,N’-carbonyldiimidazole (CDI) and the activated HT-2 toxin was let to react with aminogroups of the protein (KLH) to generate a stable carbammate linkage.
Secondary labeled antibody: Anti-mouse IgG (H+L) from horse, conjugated with Alkaline Phosphatase, concentration 1 mg/ml.	Vector Laboratories	AP-2000
HT-2 toxin	Biopure
Magnetic beads: Dynabeads®	Dynal	M-280 Tosylactivated	Concentration 2 x 109 beads/ml.

Solutions

Name of the reagent	Preparation	Comments (optional)
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Dissolve 0.20 g of potassium chloride, 0.20 g of potassium dihydrogen phosphate, 1.16 g of disodium hydrogen phosphate and 8.00 g of sodium chloride in 900 ml of water
Diethanolamine buffer, DEA, 0.97 M + 1 mM MgCl2 + 0.15 M KCl, pH 9.8	Dissolve 0.0476g of MgCl2 anhydrous and 7.3.59 g of KCl in ~ 300 ml of water. After dissolution add 51 ml of DEA (99.5%). Adjust pH to 9.8 with HCl (6 M). Dilute to 500 ml with water.
Borate buffer, 0.1 M, pH 9.5	Dissolve 3.09 g of H3BO3 in ~ 300 ml of distilled water; adjust pH to 9.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 500 ml with distilled water.
TRIS buffer, 0.2 M, pH 8.5	Dissolve 3.85 g of Tris[hydroxymethyl]-aminomethane in 100 ml of water. Adjust to pH 8.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 200 ml with water.
TRIS buffer + BSA solution (0.1%), pH 8.4	Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of TRIS buffer pH 8.4.	This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + TWEEN® 0.05%	Dissolve 0.250 g of TWEEN 20 in 500 ml of the previously prepared PBS buffer, pH 7.4
PBS buffer + BSA solution 0.1%	Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3.	This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + BSA 0.1% + NaN3 0.02%	Dissolve 0.050 g of BSA and 0.010 of NaN3 in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3.	Storage solution
Enzymatic substrate	Dissolve 0.010 g of 1-Naphthyl phosphate sodium salt in 100 ml of DEA buffer pH 9.8. Wrap the flask tightly in aluminium foil.	This solution must be freshly prepared on the day of use.
Skimmed milk blocking solution	Add 0.20 g of Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) to 200 ml of PBS buffer pH 7.3.	This solution must be freshly prepared on the day of use.
HT-2 stock solution	Dissolve 10 mg of trichothecene HT-2 toxin vial, in 10 ml of acetonitrile to give a solution with a concentration of 1 mg/ml.	Split up this solution into single-use aliquots of 30 ml and store them at less than -30 °C.
HT-2 Working standard solution	Pipette 20 ml of HT-2 toxin stock solution into a 2 ml calibrated volumetric flask and dilute with acetonitrile to obtain a HT-2 working solution containing 10 μg /ml of trichothecene toxin.	This solution should be freshly prepared on the day of use.
HT-2 Working calibrant solutions	Dilute the HT-2 working standard solution (10 μg/ml) to prepare working calibrant solution 100 ng/ml. Dilute HT-2 working calibrant solution 100 ng/ml to prepare working calibrant solutions of the following concentrations 0 (blank), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng/ml.	These solutions must be prepared fresh on the day of use.
HT-2 conjugated with KLH	Split up HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) stock solution (1 mg/ml in PBS) into single-use aliquots of 350 μl.	Store aliquots at -30 °C.
Specific Monoclonal Antibody	Dilute 1:350 (v:v) the stock concentration (1.383 mg/ml) of monoclonal antibody in PBS to use in competition step	This solution must be prepared fresh at the moment of use. 10 ml antibody stock solution in PBS for a final volume of 3.5 ml, are enough to analyze 17 standards and /or samples.
Secondary Labeled Antibody	Anti-mouse IgG (H+L) conjugated with Alkaline Phosphatase is diluted 1:100 (v:v) in PBS to use in competition step.	100 μl antibody stock solution in PBS for a final volume of 10 ml, are enough to analyze 25 standards and /or samples. This solution must be prepared fresh at the moment of use.

Apparatus

Name of the reagent	Company	Comments (optional)
Magnetic Particle Concentrator: MPC®-S	Dynal
PalmSens instrument	PalmSens	Provided with PalmSens Lite, Serial cable connecting PC laptop and Mux options software
CH8 PalmSens Multiplexer	PalmSens
Eight channel Mux electric contact	hand made
Strip with eight screen printed electrodes (SPEs)	hand made
Specially designed support for electrodes strip	hand made	Includes 8 neodymium magnets each of which is placed below each working electrode surface of the SPE
Calibrated microliter pipettes	Gilson
Magnetic stirrer and stir bars.
Glass beakers (100, 50, 20 ml).
Volumetric flasks (2ml).
0.2 and 2ml Eppendorf tubes.	Eppendorf
Falcon™ tubes of 5ml and 15ml.	Falcon
Laboratory Vortex Mixer		Do not use vortex mixer to resuspend magnetic beads coated with HT2-KLH or linked with immunological chain to avoid denaturing of proteic parts
Laboratory oven or thermostated room		Choose a oven able to keep a temperature of 37±3 °C.