我们目前合成水凝胶内的细胞的三维(3D)封装的协议。封装过程概述了交联(迈克尔型除了和光发起的自由基机制)两种常用的方法,以及评估封装细胞行为的一些技巧。
细胞内的水凝胶的3D封装代表一个日益重要和流行的技术,对培养细胞和组织工程结构的发展。这种环境中更好地模拟细胞在体内的观察 ,比较标准的组织培养,由于组织的性质和3D环境。合成聚合物水凝胶,水肿,可设计是稳定的,或通过水解或水解降解,作为新的组织沉积是由封装细胞网络。这些应用程序,如聚乙二醇(PEG)和透明质酸的聚合物的种类繁多,已探索。最常见的聚合物功能化与活性基团,如甲基丙烯酸或丙烯酸酯通过各种机制进行交联的能力。在过去的十年中,已经取得了很大的进展,工程这些微环境-例如,通过物理或高架共价纳入生化线索-以提高生存能力和直接的细胞表型,包括封装的干细胞的分化(伯迪克等)。
细胞的三维封装下面的方法进行了优化,在我们和其他实验室,以最大限度地提高细胞相容性和减少凝胶处理步骤。在以下协议(见程序的说明图1),它是假定能够发生交联官能聚合物已手;优良的高分子化学应用于组织工程领域的评论可能会发现其他地方(伯迪克等 ),这些方法都与一系列聚合物类型兼容。此外,迈克尔型除了(见Lutolf 等。)和光发起自由基(见Elisseeff 等)。机制集中在这里只占报告交联技术的一小部分。混合模式下的交联,反应性基团,其中一个部分是第一所消耗的除交联,由一个激进的机制,是常用的另一个导演(Khetan等,萨利纳斯等。)封装细胞的表型和强大的范例。
所描述的协议代表一个简单而强大的的的方法,封装在cytocompatible地细胞内的水凝胶支架。这种技术是特别重要,因为终末分化,干细胞可以表现出明显不同的行为,在2D与3D的微环境。即使涉及植入材料(如原位自由基聚合),细胞封装和分析的可行性和分化的治疗方法,可以帮助在材料的发展过程中。描述的连续过程,可用于空间处理的水凝胶环境,因此细胞的行为( 见Khetan等。 )。
总体而言,最关键的因素所描述的协议是所有使用的解决方案的同质性。特别是,应采取特殊照顾,以确保细胞是均匀地分布在预聚物溶液,并通过吸管,再悬浮的解决方案是充分混合,加入交联剂的解决方案。未能确保这一点,可能会导致聚集在凝胶结构和肿胀的细胞或局部变化。
这里介绍的协议主要集中在封装细胞的过程,重要的是还注意到,封装可能需要一些调整,以分析,通常用于2D播种的书面协议。几个例子说明,可视化和评估水凝胶中的细胞。
这项工作是由美国国家科学基金会研究生研究奖学金SK和国家保健授予R01EB008722研究所的支持。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
I2959 | Reagent | Ciba Specialty Chemicals | ||
.2 M Triethanolamine Buffer | Reagent | Sigma | T0449 | |
PBS | Reagent | Invitrogen | 14040-117 | 1x, sterile liquid |
Live/Dead staining kit | Reagent | Invitrogen | L3224 | Includes live (Calcein AM) and dead (ethidium homodimer-1) probes |
Phalloidin-FITC | Reagent | Sigma | P5282 | |
Rhodamine Phalloidin | Reagent | Invitrogen | R415 | |
DAPI | Reagent | Sigma | D9542 | |
Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho) | Reagent | Polysciences | 23591 | |
Bovine Serum Albumin | Reagent | Sigma | A7030 | |
Tween 20 | Reagent | Sigma | P1379 | |
Triton X-100 | Reagent | Sigma | T8787 | |
Citrisolv | Reagent | Fisher | 22-143975 | |
Micro-cut paraffin | Reagent | Polysciences, Inc. | 24202 | |
Trizol reagent | Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
0.22 μm pore size nylon syringe filters | Equipment | Fisher Scientific | 09-719C | |
1 mL disposable syringes | Equipment | BD biosciences | 309602 | Cut syringes at consistent height for UV exposure |
Wide orifice pipette tips | Equipment | Sigma | P6800 | |
Omnicure UV Spot Cure System with 365 nm filter | Equipment | Exfo Life Sciences Division | S1000 | |
254 nm germicidal UV light source | Equipment | Built into most biological safety cabinets |