Summary

전압에 민감한 염료를 사용하여 기니 돼지 장용 네트워크에서 전기 활동의 광학 녹음

Published: December 04, 2009
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Summary

이 프로토콜은 염료가 조정 해상도 등 기니 돼지 장용 신경계의 plexuses으로 손상 신경망에서 전기 활동의 광학 녹음을 활성화하는 방법 전압에 민감한 개념 단일 세포에서 다중 ganglionic 회로 등을 꼽을 수 있습니다.

Abstract

장용 신경계 (팔)는 격리 복잡한 행동을 수행하는 능력이 확인된 기능과 자체 네트워크를 포함하고 있습니다. 그 뉴런은 (직경 10-25 μm의) 창자 벽의 별개의 비행기를 역사는 plexuses에 배열되어<sup> 1</sup>; myenteric 신경 얼기는 세로와 원형 근육층 및 원형 근육 층과 점막 사이의 submucous 신경 얼기 사이 찾을 수 있습니다. 이러한 plexuses에 대한 이펙터 시스템 때문에 (상피 운반, 내분비 세포, 면역 요소, 혈관 및 평활근)이 또한 창자 벽에 포함된 있으며, 세미 손상 준비는 여러 반응 경로의 개별 구성 요소를 보존되는 해부하실 수 있습니다. 효과기 시스템의 동작은 콘서트에서 행동 submucous와 myenteric plexuses에 의해 제어됩니다. 따라서, 신경 사이 사이, 그리고 plexuses 간의 통신의 시냅스 상호 작용에 대한 자세한 지식은 정상적인 위장 기능을 이해하는 데 필수적입니다. 팔은 손상 신경계로 하나의 연결 네트워크 및 생리 출력의 전기적 동작과 분자 및 세포 이벤트를 상호 연관 수있는 독특한 실험 모델입니다. 때문에 plexuses의 준 2 차원 조직의 팔은 특히 전압에​​ 민감한 염료를 고용되는 여러 사이트 광 기록 기술을 사용하여 신경망의 학습에 가장 적합합니다<sup> 2,7,8,9</sup>. 우리는 여기서 비교적 새로운 naphthylstyryl – pyridinium 염색 (DI – 4 – ANEPPDHQ)의 사용을 보여주는 것입니다<sup> 3</sup> 매우 낮은 phototoxicity, 국제화의 속도가 느린 속도와 뛰어난 화학적 안정성 등 이전을 통해 여러 장점을 제공. 하위 밀리초 시간 해상도를 허용 카메라와 함께 사용할 경우,이 염료는 우리 100X 확대 ~ 2.5 μm의의 최대한의 공간 해상도로 볼 수의 분야에있는 모든 뉴런의 전기 활동을 모니터할 수 있습니다. 낮은 배율 (10X 또는 20X)에서, 단일 셀 해상도의 희생은 남북 ganglionic 회로의 복잡한를 공개, 관점의 증가에 의해 보상됩니다.

Protocol

1 부 : 조직 준비 submucous 및 myenteric 신경 얼기 준비는 1백50-2백g (이전 2-3주) isoflurane 흡입과 참수하여 anesthetized되었습니다 하틀리 기니 돼지 작은 창자에서 연속적인 절개로 절연하고 있습니다. 안락사 후, 소장은 excised과 내용은 따뜻하고, 산소 솔루션 루멘 플러싱에 의해 제거됩니다. 우리는 25 MM HEPES, 37 미리 예열되어 7.4 (M199 – DM으로, 지금부터 함) 조정 5 MM NaHCO 3 2 MM의 글루타민,…

Discussion

이 프로토콜은 두 가지 목표를 염두에두고 작성되었습니다. 첫 번째는 지난 10의 다양한 기술 발전, 전압에 민감한 염료를 사용하는 전기 활동의 광학 녹음 덕분에 그대로의 연결 네트워크를 공부에 대해 가장 강력하고, 안정적이고 저렴한 방법 중 하나가 있으며, 다른 조사를 설득하는 것입니다, 정말 그것은 쉽게 겸손한 자원을 가지고 실험실에서도 구현할 수 있습니다. 두 번째 목표는 두 가지?…

Acknowledgements

우리는 우리와 함께 자신의 기술 전문 지식을 공유에 대한 2 광자 영상의 시작 부분에 표시되는 이미지, H. 다카노를 얻기위한 자신의 2 광자 현미경을 사용하는 허용을위한 검찰 쿨터 (들어온다) 감사드립니다.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Medium 199   Sigma, St. Louis, MO M3769 With Earle’s salts Without L-Glutamine, Phenol Red and Sodium Bicarbonate
Sylgard   Dow Corning Corp., Midland, MI 184 silicone elastomer kit  
Insect pins used for dissection   F.S.T., Foster City, CA 26001-30  
Dumont forceps   F.S.T., Foster City, CA 11203-23 or 11200-33  
Moria MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors   F.S.T., Foster City, CA 15371-92  
Pins to hold the tissue during the experiment   Seirin Corp., Shizuoka, Japan Seirin Spinex  
Collagenase VII   Sigma, St. Louis, MO C0773  
Protease IX   Sigma, St. Louis, MO P6141  
Fetal Bovine Serum   Invitrogen, Carlsbad, CA 10439-016  
PenStrep   GIBCO, BRL 15140  
L-Glutamine 100X   GIBCO, BRL 25030  
Nifedipine   Sigma, St. Louis, MO    
Di-4-ANEPPDHQ   Molecular Probes, Eugene, OR D36802  
4-Channel Stimulus Generator   Multi Channel System MCS GmbH, Reutlingen, Germany 2000 Series  
Peristaltic pump   Rainin, Woburn, MA 2-channel Dinamax RP-1  
High-speed camera   RedShirtImaging, LLC Decatur, GA NeuroCCD-SM  
1:10 demagnifier / relay lens   Optem, Qioptiq Linos, Inc., Rochester, NY    
Upright microscope   Olympus Optical Co., Tokyo, Japan BX61TRF  
Gibraltar fixed stage with motorized X-Y translator   Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada PSSG–BX2  
Linear matrix electrodes   FHC, Inc., Bowdoin, ME Custom made  
Active vibration-isolation table   Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA Micro 60  
Ultra-low-ripple feedback stabilized power supply   Kepco, Flushing, NY ATE 75-15M  
Heat filter   Schott Optical Glass, Duryea, PA KG-1  
High-Q interference filter   Chroma, Inc., Rockingham, VT HQ530/50  
Dichroic mirror   Chroma, Inc., Rockingham, VT 565 nm (50% transmission)  
Long-pass filter   Chroma, Inc., Rockingham, VT HQ572LP  
Acoustic curtains   Acoustical Surfaces, Inc. BSC-25  
Neuroplex   RedShirtImaging, Inc., Decatur, GA    
IDL   ITT Visual Information Solutions, Boulder, CO    
High-resolution CCD camera, with its own camera controller   Hamamatsu Photonics, KK, Hamamatsu City, Japan    
Frame-grabber for high-resolution camera   Data Translation, Marlboro, MA DT3120K-1  
Imaging software for high-resolution camera   Data Translation, Marlboro, MA Global Lab Image/2  

References

  1. Costa, M. a. r. c. e. l. l. o., Furness, J. o. h. n. . B., Llewellyn-Smith, I. J., Johnson, L. e. o. n. a. r. d. . R. . in Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Leonard R. , 1-1 (1987).
  2. Obaid, A. L. Spatiotemporal patterns of activity in an intact mammalian network with single-cell resolution: optical studies of nicotinic activity in an enteric plexus. J Neurosci. 19 (8), 3073-3073 (1999).
  3. Obaid, A. L., Loew, L. M., Wuskell, J. P., Salzberg, B. M. Novel naphthylstyryl-pyridinium potentiometric dyes offer advantages for neural network analysis. J. Neurosci. Methods. 134 (2), 179-179 (2004).
  4. Hirst, G. D., McKirdy, H. C. Synaptic potentials recorded from neurones of the submucous plexus of guinea-pig small intestine. J Physiol (Lond). 249 (2), 369-369 (1975).
  5. Salzberg, B. M., Barker, J., McKelvy, J. Current Methods in Cellular Neurobiology. , 139-139 (1983).
  6. Salzberg, B. M. An ultra-stable non-coherent light source for optical measurements in neuroscience and cell physiology. Journal of Neuroscience Methods. 141, 165-16 (2005).
  7. Obaid, A. L., Nelson, M. E., Lindstrom, J., Salzberg, B. M. Optical studies of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in the guinea-pig enteric nervous system. J Exp Biol. 208 (Pt 15), 2981-2981 (2005).
  8. Obaid, A. L., Zou, D. J., Rohr, S., Salzberg, B. M. Optical recording with single cell resolution from a simple mammalian nervous system: Electrical activity in ganglia from the submucous plexus of the guinea-pig ileum. Biol. Bull. 183, 344-344 (1992).
  9. Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246 (5434), 508-508 (1973).
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Cite This Article
Obaid, A. L., Salzberg, B. M. Optical Recording of Electrical Activity in Guinea-pig Enteric Networks using Voltage-sensitive Dyes. J. Vis. Exp. (34), e1631, doi:10.3791/1631 (2009).

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