العزلة واشتقاق خلايا الفأر الجنينية بيرشوت
Summary
قدرة الخلايا الجنينية جرثومي على التمايز إلى خلايا جرثومي البدائية خلال مراحل النمو المبكر هو نموذج مثالي لمعالجة فرضيتنا حول السرطان والعقم. هذا البروتوكول يوضح كيفية عزل خلايا جرثومي البدائية من المناسل النامية في الأجنة 10،5-11،5 أيام آخر coitum الماوس.
Abstract
قدرة الخلايا الجنينية جرثومي (مصر) على التمايز إلى خلايا بدائية جرثومي (PGCs) ولاحقا في الأمشاج خلال مراحل النمو المبكرة هو نموذج مثالي لمعالجة فرضيتنا حول السرطان والعقم. هذا البروتوكول يوضح كيفية عزل خلايا جرثومي البدائية من المناسل النامية في آخر أيام 10،5-11،5 الأجنة coitum الماوس (DPC). النامية التلال الغدد التناسلية من أجنة الفئران (C57BL6J) تم فصلها عن اضطراب الميكانيكية مع كولاجيناز ، ثم في مطلي بطبقة جنين الفأر تغذية الخلايا الليفية (MEF – CF1) الذي كان سابقا مع المعطل mitotically C mitomycin في حضور وسائل الإعلام وتستكمل مع خروج المغلوب المانع اللوكيميا عامل (LIF) ، عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) ، والخلية الجذعية عامل (SCF). باستخدام هذه الأساليب الأمثل لتحديد PCG ، والعزلة ، وتهيئة الظروف ثقافة تصاريح الثقافات على المدى الطويل من الخلايا المصري لأكثر من 40 يوما. وأظهرت خطوط الخلايا الجنينية جرثومي النمط الظاهري الجنينية والتعبير عن علامات مشتركة تستخدم الدولة المحفزة. العزلة واشتقاق خلايا جرثومي في الثقافة توفير أداة لفهم تنميتها في المختبر ، وتتيح الفرصة لرصد الأضرار المتراكمة على المستويات الجينية واللاجينية بعد التعرض لالاكسدة.
Protocol
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أن نعترف مساعدة لا تقدر بثمن من : الدكتور نيل الأولى ويلكنسون Kourtney للتحرير المخطوط ، والدكتورة لوسي سنتر ، والدكتور Willeford بريجيت ومايك Basett للمساعدة في تدريب ورعاية الحيوان في جامعة ولاية ميشيغان مرفق ALAC الماوس المعتمدة ، والدكتور دواين وايز للحصول على المساعدة مع المجهري والتقاط الصور ؛ سيزار مونروي ، Swoope هانا ، وبوبي هدلستون لمساعدتها في إنتاج الفيديو في جامعة ولاية ميشيغان. وقد تم تمويل هذا البحث من قبل مكتب البحوث المؤسسية وإدارة العلوم البيولوجية في جامعة ولاية ميسيسيبي.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10.5 – 11.5 dpc pregnant C57BL6J female mouse crossed with the same background male mouse. | ||||
| Mouse Fibroblast MEF-CF1 ATCC | SCRC-1040 | |||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Invitrogen | 14190/086 | ||
| Collagenase /Dispase Solution | Roche | 269638 | ||
| Gelatin | Sigma | G1890 | ||
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | ||
| Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200-072 | ||
| MEF Medium: Dulbecco Medium Eagle Modified (D-MEM) GLUTAMAX High glucose | Invitrogen | 10566024 | ||
| 10% Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000/044 | ||
| 1% of antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | ||
| Knockout Media: 80% knockout D-MEM | Invitrogen | 10829/018 | ||
| 20% Knockout serum Invitrogen Cat. No. 1028/028, 200mM L-glutamine Invitrogen | 25130/081 | with β-mercaptoethanol Sigma Catalogue Number: M7522 | ||
| 1X non essential amino acid solution | Invitrogen | 11140/050 | ||
| 1% antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | supplemented with grow factor as 2500 U of Leukemia inhibitory factor (mLIF-ESGRO) Millipore Catalogue Number: ESG1106 | |
| 40 ng/ml of Recombinant Murine Stem Cell Factor (SCF) ReproTech | 250-03 | |||
| 20 ng/ml of Basic Fibroblast Growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256-029 | ||
| Corning center well culture dish 60mm | Fisher | 07-200-79 | 1.5 ml eppendorf tube, and 15 ml falcon tubes |
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
References
- DeFelici, M. . Cell Biology: A laboratory Handbook. 1, 73-85 (1998).
- Donovan, P. J., De Miguel, M. P. Turning Germ Cells into Stem Cells. Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).
- Labosky, P. A., Hogan, B. L. M., Sharp, P. T., Mason, I. Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: isolation and in vitro culture. Molecular embryology: methods and protocols. 97, (1999).
- Mc Laren, A., Southee, D. Entry of Mouse Embryonic Germ Cells into Meiosis. 발생학. 187, 107-113 (1997).
- Yoshimizu, T., Obinata, M., Matsui, Y. Stage-specific tissue and cell interactions play key roles in mouse germ cell specification. Development. 128, 481-490 (2001).
- Zhang, J., Hhvorostov, I., Teitell, M. From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs. J Vis Exp. , (2008).
