우리는 흡입 전극을 사용하여 단일 마우스 콘에서 플래시 응답을 기록하는 방법을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
망막에있는 막대와 원뿔 photoreceptors 빛을 감지 책임이 있습니다. 어둠에서 바깥쪽 구간에 주기적 염기 - 게이 티드 (CNG) 채널 오픈하고 양이온이 세포 depolarizing, 멤브레인 안쪽에 걸쳐 꾸준히 흐름을 수 있습니다. 라이트 노출은 CNG 채널, 블록 안쪽 양이온 전류 흐름, 따라서 세포 hyperpolarization 결과의 폐쇄를 실행시킵니다. photoreceptors의 극성에 따라 흡입 녹음 방법은 고전적인 패치 - 클램프 기법과는 달리, 플라즈마 막을 관통 필요하지 않습니다, 1970 년대에 개발되었습니다
프로토콜
전극 만들기
- micropipette의 풀러를 사용하여 기록 전극을 만들어 현미경으로 가열 필라멘트와 전극을 폴란드어. 마우스 콘 단일 셀 흡입 녹음, 전극 팁의 내부 직경 6-7 μm의 약입니다.
- 참조 전극을 준비합니다. 증류수 1 %의 한천을 나가는거야. 온수 욕조에있는 한천 솔루션을 용융. 주사기를 사용하여 1 %의 한천과 유리 pipettes을 (L = 100mm, OD / ID = 1/0.75 ㎜) 입력합니다. 10 분 상온에서 한천을 응고.
- 다이아몬드 나이프를 사용하여 반쪽에 pipettes 컷.
- 4 최소 24 시간에 대한 참조 솔루션에서 참조 전극을 소크 ° C.
실험 설정
- 다크 하룻밤 검은 새장에 마우스를 적응.
- 100 ML 참조 솔루션 1 L 재관류 솔루션 (아래 참조) 준비와 솔루션을 필터링합니다.
- 0.1 % BSA 20 ML 참조 솔루션 10 MM의 혈당을 디졸브.
- 광도계를 사용하여 광학 자극기의 빛을 강도를 보정합니다.
- 거꾸로 현미경의 무대에서 기록 챔버를 탑재합니다.
- 95% O 2 / 5% ....
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토론
photoreceptor 세포에서 단일 세포 흡입 기록은 3 년 전 개발되었습니다. 이것은 세포막을 관통하지 않고 빛의 자극에 의해 유도된 횡단 막 전류 변화를 기록하는 데 있습니다. 때문에 높은 세포 - 세포 부착, 이건 수륙 양용 망막과 같은 마우스 망막에서 건강한 하나의 막대와 원뿔을 분리하기 어려운이며 그것은 낮은 비율 (3 %)과 작은 크기로 인해 각각의 원뿔을 찾을 수 어렵습니다. 내부 세그먼트 기능 (IS -)를 기록 방법은 원추형이 포함될 수 있습니다 그중 몇 가지 photoreceptors의 내부 세그먼트의 현재 기록하여이 어려움을 극복. 야생 타입 마우스에 반응은 막대와 원뿔의 조합해야합니다. 꾸준한 배경 조명은 막대의 반응을 억제하는 데 사용할 수 있습니다. 망막들이 G - 단백질 transducin 6 α - subunit 부족으로 막대가 가벼운 자극에 응답하지 수있는 -이 비디오에서는, 우리는 Tα - /를 사용합니다. 따라서 photoresponse는 원뿔에서입니다.
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감사의 글
실명과 어이 02687을 (워싱턴 대학에서 안과 & 비주얼 과학 계열) 방지하기 위해 연구에서 실명, NIH 그랜트 어이 019,312, 그리고 무제한 부여를 방지하기 위해 연구에서 경력 개발 상을 지원.
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참고문헌
- Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments. Nature. 269, 78-80 (1977).
- Nikonov, S. S. Photoreceptors of Nrl -/- mice coexpress functional S- and M-cone....
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재인쇄 및 허가
