Wir beschreiben eine Methode zur Beobachtung der Echtzeit-Replikation einzelner DNA-Moleküle durch Proteine des Bakteriophagen Replikationssystem vermittelt.
Abstract
Wir beschreiben eine Methode zur Beobachtung der Echtzeit-Replikation einzelner DNA-Moleküle durch Proteine des Bakteriophagen Replikationssystem vermittelt. Linearisierte λ DNA wird modifiziert, um ein Biotin auf das Ende eines Stranges, und ein Digoxigenin-Rest am anderen Ende des gleichen Strang zu haben. Der biotinylierte Ende mit einem funktionalisierten Deckglas und die digoxigeninated Ende eine kleine Perle befestigt. Die Montage dieser DNA-Bead Anbindehaltung auf der Oberfläche einer Durchflusszelle ermöglicht eine Laminar-Flow anzuwenden, um eine Zugkraft auf dem Wulst auszuüben. Als Ergebnis wird die DNA in der Nähe und parallel zur Oberfläche des Deckglases mit einer Kraft, die durch den Durchfluss (Abbildung 1) bestimmt wird gestreckt. Die Länge der DNA wird durch die Überwachung der Position der Perle gemessen. Länge Unterschiede zwischen Einzel-und Doppelstrang-DNA werden genutzt, um in Echtzeit Informationen über die Tätigkeit der Replikation Proteine an der Gabelung zu erhalten. Die Messung der Position der Sicke ermöglicht eine präzise Bestimmung der Preise und processivities von DNA Abwickeln und Polymerisation (Abbildung 2).
Protocol
1. DNA Replication Vorlage DNA für die Reaktion ist ein linearisierter λ-DNA durch Glühen von Oligonukleotiden zu einer Replikationsgabel Form modifiziert. Darüber hinaus ist Biotin an das Ende eines Stranges der λ DNA befestigt, und ein Digoxigenin-Rest ist an das andere Ende des gleichen Strang 1 beigefügt. Werkstoffe: Bakteriophagen λ DNA, Oligonukleotide: biotinylierten Gabelarm (A: 5'-Biotin-AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGAT…
Discussion
Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Zugkraft auf Kügelchen von Laminar-Flow ausgeübt hat keinen Einfluss auf enzymatische Aktivitäten der Replikation Proteine. Zum Beispiel hat ein 3 pN Kraft, die zu einem Durchfluss von 0,012 ml / min entspricht nicht berührt Replikation der DNA-Strang führt. Es hat jedoch Auswirkungen auf enzymatische Aktivitäten, die während koordiniert die DNA-Synthese, und es muss daher auf 1,5 pN reduziert werden. Die Zugkraft kann durch Änderung der Strömungsgeschwindigkeit oder…
Acknowledgements
Die Entwicklung der DNA Stretching Assay wurde durch Paul Blainey, Jong-Bong Lee, und Samir Hamdan unterstützt. Diese Arbeit wird durch die National Institutes of Health gewährt Charles Richardson (GM54397) und Antoine van Oijen (GM077248) unterstützt.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Bacteriophage λ DNA
New England Biolabs
N3011L
DNA Oligonucleotides
Integrated DNA Technologies
T4 DNA Ligase
New England Biolabs
M0202L
T4 Polynucleotide Kinase
New England Biolabs
M0201L
α-digoxigenin Fab
Roche
11214667001
Tosyl Activated Beads
Dynal/Invitrogen
142-03
Magnetic Separator
Invitrogen
Dynal MPC
3-aminopropyl-triethoxysilane
Sigma
A3648
Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces
Succinimidyl propionate PEG
Nektar
Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Biotin-PEG-NHS
Nektar
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Double-sided tape
Grace BioLabs
SA-S-1L
100 μm thickness
Quartz slide
Technical Glass
20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H)
Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net)
Polyethylene tubing
Becton Dickinson
427416
0.76 mm ID, 1.22 OD
Other size tubing can be substituted.
Streptavidin
Sigma
S4762
Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3
Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix
New England Biolabs
N0447
Inverted Optical Microscope with 10X Objective
Olympus
Olympus IX-51
Permament rare-earth magnet
National Imports
www.rare-earth-magnets.com
CCD Camera
QImaging
Rolera-XR Fast 139
Syringe Pump
Harvard Apparatus
11 Plus
Operate in refill mode to facilitate solution changes
Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay. J. Vis. Exp. (37), e1689, doi:10.3791/1689 (2010).