Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos
Summary
Hemócitos Drosophila dispersam sobre a totalidade do embrião em desenvolvimento. Este protocolo demonstra como montar e imagem essas migrações usando embriões com hemócitos fluorescente etiquetado.
Abstract
Muitos estudos de migração de células endereço usando<em> In vitro</emMétodos>, enquanto que o ambiente fisiologicamente relevante é a do próprio organismo. Aqui apresentamos um protocolo para a montagem de<em> Drosophila melanogaster</em> Embriões e imagens ao vivo subseqüente de hemócitos fluorescente etiquetado, os macrófagos embrionário deste organismo. Usando o sistema Gal4-uas<sup> 1</sup> Nós dirigimos a expressão de uma variedade de milho geneticamente codificado, marcadores fluorescentes marcado em hemócitos de seguir sua dispersão ao longo do desenvolvimento do embrião. Após a coleta de embriões no estágio de desenvolvimento desejado, o córion externa é removida e os embriões são, então, montado em óleo halocarbono entre um hidrofóbico, gás-permeáveis membrana e uma lamela de vidro para imagens ao vivo. Além bruta parâmetros migratórias, tais como velocidade e direção, a imagem de alta resolução juntamente com o uso de repórteres fluorescentes de F-actina e microtúbulos pode fornecer informações mais detalhadas sobre a dinâmica desses componentes do citoesqueleto.
Protocol
Discussion
Os elementos mais importantes deste processo são a seleção de embriões saudáveis com hemócitos claramente identificados e montá-los sem danificá-los com cuidado. Uma vez que os embriões são no óleo halocarbonos são resistentes à desidratação e uma vez montada pode ser trabalhada por várias horas. Em nossas mãos, podemos hemócitos imagem para três horas, com desidratação insignificante do embrião ou do óbvio foto danos, tendo um z-stack de imagens a cada três minutos no nosso microscópio co…
Acknowledgements
Este protocolo foi desenvolvido através de nosso trabalho dentro e em colaboração com os laboratórios de Paul Martin e Antonio Jacinto. Agradecemos ao Centro de Ações Bloomington pelo seu excelente serviço e da comunidade Drosophila para continuar compartilhando linhas de voar. BS é atualmente financiado por uma doação do projeto BBSRC. WW é financiado por uma bolsa de Desenvolvimento de Carreira Wellcome Trust.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cell strainer | BD Falcon | 352350 | 70μm pores | |
| Halcarbon oil 700 | Sigma | H8898 | ||
| Lumox/Petriperm dish | Sarstedt | 96077305 |
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