Hemócitos Drosophila dispersam sobre a totalidade do embrião em desenvolvimento. Este protocolo demonstra como montar e imagem essas migrações usando embriões com hemócitos fluorescente etiquetado.
Abstract
Muitos estudos de migração de células endereço usando<em> In vitro</emMétodos>, enquanto que o ambiente fisiologicamente relevante é a do próprio organismo. Aqui apresentamos um protocolo para a montagem de<em> Drosophila melanogaster</em> Embriões e imagens ao vivo subseqüente de hemócitos fluorescente etiquetado, os macrófagos embrionário deste organismo. Usando o sistema Gal4-uas<sup> 1</sup> Nós dirigimos a expressão de uma variedade de milho geneticamente codificado, marcadores fluorescentes marcado em hemócitos de seguir sua dispersão ao longo do desenvolvimento do embrião. Após a coleta de embriões no estágio de desenvolvimento desejado, o córion externa é removida e os embriões são, então, montado em óleo halocarbono entre um hidrofóbico, gás-permeáveis membrana e uma lamela de vidro para imagens ao vivo. Além bruta parâmetros migratórias, tais como velocidade e direção, a imagem de alta resolução juntamente com o uso de repórteres fluorescentes de F-actina e microtúbulos pode fornecer informações mais detalhadas sobre a dinâmica desses componentes do citoesqueleto.
Protocol
Preparação Obter linhas apropriadas Drosophila contendo um hemócitos específicos Gal4 driver (por exemplo, srp-Gal4 2) e um repórter geneticamente codificado fluorescente sob controle UAS (por exemplo, uas-GFP). Moscas homozigotos para srp-Gal4, uas-GMA 3 ou CRQ-Gal4, uas-GFP 4, 5 são particularmente úteis para fins de imagem (nb GMA é GFP fundida ao domínio de ligação de actina de moesin), veja abaixo para uma discussão…
Discussion
Os elementos mais importantes deste processo são a seleção de embriões saudáveis com hemócitos claramente identificados e montá-los sem danificá-los com cuidado. Uma vez que os embriões são no óleo halocarbonos são resistentes à desidratação e uma vez montada pode ser trabalhada por várias horas. Em nossas mãos, podemos hemócitos imagem para três horas, com desidratação insignificante do embrião ou do óbvio foto danos, tendo um z-stack de imagens a cada três minutos no nosso microscópio co…
Acknowledgements
Este protocolo foi desenvolvido através de nosso trabalho dentro e em colaboração com os laboratórios de Paul Martin e Antonio Jacinto. Agradecemos ao Centro de Ações Bloomington pelo seu excelente serviço e da comunidade Drosophila para continuar compartilhando linhas de voar. BS é atualmente financiado por uma doação do projeto BBSRC. WW é financiado por uma bolsa de Desenvolvimento de Carreira Wellcome Trust.
Evans, I. R., Zanet, J., Wood, W., Stramer, B. M. Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations. J. Vis. Exp. (36), e1696, doi:10.3791/1696 (2010).