スプリットユビキチンによる膜酵母ツーハイブリッド（神話）システム：タンパク質間相互作用を識別するための強力なツール
Summary
神話では、モデル生物出芽酵母で発現されるタンパク質間の過渡と安定な相互作用を高感度に検出することができます。それが正常にハイスループットな方法でそれらの相互作用パートナーを同定するために、外因性および酵母内在性膜タンパク質の研究に適用されています。
Abstract
内在性膜タンパク質の基本的な生物学的及び臨床的重要性は、完全長の膜貫通型タンパク質のタンパク質間相互作用（PPI）の高スループットを識別するための酵母ベースのシステムの開発を促した。この目的のために、私たちの研究室では、スプリットユビキチン系膜酵母ツーハイブリッド（神話）システムを開発した。この技術は使用して過渡安定したタンパク質相互作用の高感度な検出が可能<em>サッカロマイセスセレビシエ</em>宿主生物として。神話は、ユビキチンが2つの安定した部分に分離することができるという観察を利用しています：酵母ユビキチン（CのC末端側半分を<sub> UB</sub>）とユビキチン部分のN末端側半分（N<sub> UB</sub>）。神話では、この原則は、タンパク質 – タンパク質相互作用の"センサー"として使用するために適合されている。簡単に言えば、内在性膜baitタンパク質は、Cに融合される<sub> UB</sub>人工的な転写因子にリンクされている。獲物のタンパク質は、個々のまたはライブラリの形式のどちらかで、Nに融合させ<sub> UB</sub>部分。餌と獲物との間のタンパク質相互作用は、フルレングス"疑似ユビキチン"分子を形成し、ユビキチン部分の再構成につながる。この分子は、転写因子の開裂、およびレポーター遺伝子の発現のその後の誘導の結果、細胞質脱ユビキチン化酵素によって認識される順番になります。システムは、高度な適応性であり、特にハイスループットスクリーニングに適しています。それが正常酵母と他の生物の両方から内在性膜タンパク質を使用して相互作用を調査するために採用されている。
Protocol
Discussion
神話は、完全長の膜タンパク質と細胞質または膜結合パートナー間の相互作用の同定を可能にする最初のハイスループットシステムです。それは生物[3-7]の範囲から膜タンパク質を研究するために使用されています。タンパク質の-利益を確保するために精査する必要があるかもしれない具体的な詳細は、しかし、存在する神話と一緒に勉強するために適している。
多く?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、この原稿の重要な読書のために夜明けのエドモンズに感謝します。 Stagljarラボは、イノベーションのためのカナダの財団（CFI）、健康研究（CIHR）、心臓や脳卒中財団、カナダの癌協会、およびノバルティスのためのカナダの研究所からの資金によってサポートされています。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Polyethenlene Glycol (PEG3350) | Bioshop | PEG335 | ||
| Lithium Acetate Bihydrate | Bioshop | LIA001 | ||
| X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D-galactopyranoside) | Bioshop | XGA001 | ||
| N`,N-dimethyl formamide | Bioshop | DMF 451 | ||
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Bioshop | ATT124 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Bioshop | SPD307 | ||
| Sodium phosphate monobasic | FisherBiotech | BP329-500 | ||
| Salmon Sperm DNA | VWR | CA80601-120 | ||
| D-Glucose | Bioshop | GLU501 | ||
| LB Broth LENOX | Bioshop | LBL405 | ||
| Yeast Nitrogen Base | Bioshop | YNB406 | ||
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401 | ||
| Peptone | Beckton Dickinson | 211677 | ||
| Bio-Tryptone | Bioshop | TRP402 | ||
| Adenine Sulphate | Bioshop | ADS201 | ||
| L-Uracil | Bioshop | URA241 | ||
| L-Threonine | Bioshop | THR002 | ||
| L-Histidine | Bioshop | HIS200 | ||
| L-Methionine | Bioshop | MET222 | ||
| L-Valine | Bioshop | VAL201 | ||
| L-Phenylalanine | Bioshop | PHA302 | ||
| L-Isoleucine | Bioshop | ISO910 | ||
| L-Tyrosine | Bioshop | TYR333 | ||
| L-Leucine | Bioshop | LEU222 | ||
| L-Arginine | Bioshop | ARG006 | ||
| L-Tryptophane | FisherBiotech | BP395-100 | ||
| L-Lysine | Bioshop | LYS101 | ||
| L-Alanine | FisherBiotech | BP369-100 | ||
| Agar | Bioshop | AGR001 | ||
| Soda Lime Galss Beads | BioSpec Product | 11079105 | ||
| Sodium Chloride | Bioshop | SLD002 |
References
- Stagljar, I., Fields, S. Analysis of membrane protein interactions using yeast-based technologies. Trends Biochem Sci. 27 (11), 559-563 (2002).
- Iyer, K. Utilizing the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system to identify protein-protein interactions of integral membrane proteins. Sci STKE. 275, pl3-pl3 (2005).
- Paumi, C. M. Mapping protein-protein interactions for the yeast ABC transporter Ycf1p by integrated split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid analysis. Mol Cell. 26 (1), 15-25 (2007).
- Stagljar, I. A genetic system based on split-ubiquitin for the analysis of interactions between membrane proteins in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5187-5192 (1998).
- Gisler, S. M. Monitoring protein-protein interactions between the mammalian integral membrane transporters and PDZ-interacting partners using a modified split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1362-1377 (2008).
- Scheper, W. Coordination of N-glycosylation and protein translocation across the endoplasmic reticulum membrane by Sss1 protein. J Biol Chem. 278 (39), 37998-38003 (2003).
- Thaminy, S. Identification of novel ErbB3-interacting factors using the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Genome Res. 13 (7), 1744-1753 (2003).
- Johnsson, N., Varshavsky, A. Split ubiquitin as a sensor of protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (22), 10340-10344 (1994).
- Kelleher, D. J., Gilmore, R. The Saccharomyces cerevisiae oligosaccharyltransferase is a protein complex composed of Wbp1p, Swp1p, and four additional polypeptides. J Biol Chem. 269 (17), 12908-12917 (1994).
- Chevallier, M. R. Cloning and transcriptional control of a eucaryotic permease gene. Mol Cell Biol. 2 (8), 977-984 (1982).
