Split-Ubiquitina membrana a base di lievito Due-Hybrid (MITO) Sistema: un potente strumento per identificare interazioni proteina-proteina
Summary
MITO permette di rilevare sensibile delle interazioni transienti e stabili tra proteine che sono espresse nel modello organismo Saccharomyces cerevisiae. E 'stato applicato con successo allo studio esogeni e lievito proteine integrali di membrana allo scopo di individuare i propri partner che interagiscono in modo elevato throughput.
Abstract
L'importanza fondamentale biologici e clinici di proteine di membrana integrali portato allo sviluppo di un lievito-based per la high-throughput identificazione di interazioni proteina-proteina (PPI) per la full-length proteine transmembrana. A tal fine, il nostro laboratorio ha sviluppato il split-ubiquitina lievito base a membrana a due ibridi (MITO) del sistema. Questa tecnologia consente per la rilevazione delle interazioni proteina sensibile transitoria e stabile con<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Come un organismo ospite. MITO sfrutta l'osservazione che ubiquitina può essere separata in due frazioni stabili: il C-terminale di lievito ubiquitina (C<sub> Ub</sub>) E la N-terminale della frazione ubiquitina (N<sub> Ub</sub>). Nel mito, questo principio è adattati per essere utilizzati come un 'sensore' di interazioni proteina-proteina. In breve, l'integrale delle proteine di membrana esca è fuso C<sub> Ub</sub> Che è legata ad un fattore di trascrizione artificiale. Proteine prede, sia in formato singolo o una raccolta, si fondono alla N<sub> Ub</sub> Porzione. Interazione tra proteine l'esca e preda porta alla ricostituzione della combinazione di sostanze ubiquitina, formando un full-length 'pseudo-ubiquitina' molecola. Questa molecola è a sua volta riconosciuto da enzimi citosolici deubiquitinating, con conseguente scissione del fattore di trascrizione, ed alla susseguente induzione dell'espressione del gene giornalista. Il sistema è altamente adattabile, ed è particolarmente adatto a high-throughput screening. E 'stato impiegato con successo per studiare le interazioni con proteine integrali di membrana da entrambi i lieviti ed altri organismi.
Protocol
Discussion
MITO è il primo sistema ad alto rendimento che permette l'identificazione delle interazioni tra full-length proteine di membrana e citosoliche o legata alla membrana partner. E 'stato utilizzato per lo studio delle proteine di membrana di una serie di organismi [3-7]. Vi sono, tuttavia, i dettagli specifici che potrebbero dover essere esaminato per assicurare la proteina d'interesse è riconducibile a studiare con MITO.
Molte proteine di membrana sono diretti a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Edmonds Alba per una lettura critica di questo manoscritto. Il laboratorio Stagljar è sostenuto da fondi della Fondazione canadese per l'innovazione (CFI), il Canadian Institute for Health Research (CIHR), la Fondazione cardiache e ictus, la Canadian Cancer Society, e Novartis.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Polyethenlene Glycol (PEG3350) | Bioshop | PEG335 | ||
| Lithium Acetate Bihydrate | Bioshop | LIA001 | ||
| X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D-galactopyranoside) | Bioshop | XGA001 | ||
| N`,N-dimethyl formamide | Bioshop | DMF 451 | ||
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Bioshop | ATT124 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Bioshop | SPD307 | ||
| Sodium phosphate monobasic | FisherBiotech | BP329-500 | ||
| Salmon Sperm DNA | VWR | CA80601-120 | ||
| D-Glucose | Bioshop | GLU501 | ||
| LB Broth LENOX | Bioshop | LBL405 | ||
| Yeast Nitrogen Base | Bioshop | YNB406 | ||
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401 | ||
| Peptone | Beckton Dickinson | 211677 | ||
| Bio-Tryptone | Bioshop | TRP402 | ||
| Adenine Sulphate | Bioshop | ADS201 | ||
| L-Uracil | Bioshop | URA241 | ||
| L-Threonine | Bioshop | THR002 | ||
| L-Histidine | Bioshop | HIS200 | ||
| L-Methionine | Bioshop | MET222 | ||
| L-Valine | Bioshop | VAL201 | ||
| L-Phenylalanine | Bioshop | PHA302 | ||
| L-Isoleucine | Bioshop | ISO910 | ||
| L-Tyrosine | Bioshop | TYR333 | ||
| L-Leucine | Bioshop | LEU222 | ||
| L-Arginine | Bioshop | ARG006 | ||
| L-Tryptophane | FisherBiotech | BP395-100 | ||
| L-Lysine | Bioshop | LYS101 | ||
| L-Alanine | FisherBiotech | BP369-100 | ||
| Agar | Bioshop | AGR001 | ||
| Soda Lime Galss Beads | BioSpec Product | 11079105 | ||
| Sodium Chloride | Bioshop | SLD002 |
References
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