Un protocole pour la production de KLRG1 tétramère
Summary
Ce protocole décrit la production de KLRG1 tétramère, qui est un outil puissant pour l'analyse des KLRG1 ligands.
Abstract
Récepteurs des cellules tueuses G1 lectine-like (KLRG1) est un récepteur de type II glycoprotéine transmembranaire inhibiteurs appartenant au type C de type lectine superfamille. KLRG1 existe à la fois comme un monomère et comme un homodimère ponts disulfure. Ce récepteur est bien conservé se trouve sur la plupart des cellules matures et récemment NK activées ainsi que sur un sous-ensemble de lymphocytes T effecteurs / mémoire.
Utiliser KLRG1 tétramère ainsi que d'autres méthodes, E, N, et R-cadhérines ont été identifiés comme KLRG1 ligands. Ces Ca 2 + cellulaire dépendante des molécules d'adhésion cellulaire comprend un domaine extracellulaire contenant cinq répète cadhérine responsable des interactions cellule-cellule, un domaine transmembranaire et un domaine cytoplasmique qui est liée au cytosquelette d'actine.
Génération du tétramère KLRG1 était essentielle pour l'identification des ligands KLRG1. KLRG1 tétramère est également un outil unique pour élucider la cadhérine rôles et jouer dans la régulation de KLRG1 la réponse immunitaire et l'intégrité des tissus.
Protocol
Discussion
Dans ce protocole, il est montré comment purifier, biotinyler et KLRG1 tetramerize. KLRG1 tétramère peut être utilisé pour étiqueter KLRG1 ligands par cytométrie en flux. Bien que les conditions de repliement devra être testé empiriquement pour chaque protéine, d'autres lectines de type C pourrait être tetramerized utilisant un protocole similaire. En utilisant des protéines tetramerized comme sondes, des ligands de récepteurs orphelin lectine de type C pourrait potentiellement être identifiés.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Naidenko pour les aider à optimiser les conditions de repliement. Ce travail a été soutenu par le NIH recherche AI58181 accorder à Laurent Brossay. Cindy Banh est soutenu par les NIH NRSA F31 AI080230.
Stephanie Terrizzi et Cindy Banh contribuent également à ce travail.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BirA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free | Reagent | Roche | 11 836 170 001 | or equivalent |
| Amicon Stirred Cell | Equipment | Millipore | Model #8400 | or equivalent |
| YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane | Filtration Supply | Millipore | 13642 | |
| 15 ml YM10 concentrator | Filtration Supply | Millipore | 4411 | |
| AKTAFPLC | Equipment | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column | Equipment | GE Healthcare | 17-1166-01 | |
| Strepavidin PE | Reagent | BD Biosciences | 554061 | or equivalent |
References
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