פרוטוקול לייצור KLRG1 Tetramer
Summary
פרוטוקול זה מתאר את ייצור KLRG1 tetramer, אשר הוא כלי רב עוצמה לניתוח KLRG1 ligands.
Abstract
תא רוצח לקטינים כמו קולטן ה-G1 (KLRG1) הוא סוג II הטרנסממברני גליקופרוטאין קולטן מעכבות השייכים superfamily לקטינים כמו סוג ג'. KLRG1 קיים הן מונומר וכן homodimer דיסולפיד צמודות. קולטן זה היטב נשמרת נמצא על תאים NK בוגרת ביותר הופעל לאחרונה, כמו גם על קבוצת תאים T מפעיל / זיכרון.
שימוש KLRG1 tetramer כמו גם שיטות אחרות, דואר, N-, ו-R-cadherins זוהו KLRG1 ligands. אלה Ca 2 + תלויי תאים תאים מולקולות הדבקה כוללת של תחום תאי המכיל חמש חזרות cadherin אחראי תאים תאים אינטראקציות, תחום הטרנסממברני ואת תחום cytoplasmic המקושר cytoskeleton אקטין.
הדור של tetramer KLRG1 היה חיוני לזיהוי של KLRG1 ligands. KLRG1 tetramer היא גם כלי ייחודי כדי להבהיר את cadherin תפקידים לשחק KLRG1 בוויסות התגובה החיסונית ושלמות הרקמות.
Protocol
Discussion
בפרוטוקול זה, הראה כיצד לטהר, biotinylate ו KLRG1 tetramerize. KLRG1 tetramer ניתן להשתמש בתווית KLRG1 ligands ידי cytometry הזרימה. למרות התנאים refolding יצטרך להיבדק באופן אמפירי של חלבון זה לזה, C-סוג לקטינים יכול להיות tetramerized באמצעות פרוטוקול דומה. באמצעות חלבונים tetramerized כמו בדיקות, ligands ל-C מסוג קול?…
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר Naidenko עזרה אופטימיזציה התנאים refolding. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק מחקר AI58181 אל לורן Brossay. סינדי Banh נתמך על ידי NIH NRSA F31 AI080230.
סטפני Terrizzi וסינדי Banh לתרום באופן שווה על עבודה זו.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BirA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free | Reagent | Roche | 11 836 170 001 | or equivalent |
| Amicon Stirred Cell | Equipment | Millipore | Model #8400 | or equivalent |
| YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane | Filtration Supply | Millipore | 13642 | |
| 15 ml YM10 concentrator | Filtration Supply | Millipore | 4411 | |
| AKTAFPLC | Equipment | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column | Equipment | GE Healthcare | 17-1166-01 | |
| Strepavidin PE | Reagent | BD Biosciences | 554061 | or equivalent |
References
- Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1. Int Immunol. 19, 391-400 (2007).
- Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1. J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).
- Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity. J Exp Med. 203, 289-295 (2006).
- Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition. Immunity. 31, 35-46 (2009).
- Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1). J Biol Chem. , .
