Ett protokoll för produktion av KLRG1 tetramer
Summary
Detta protokoll beskriver produktionen av KLRG1 tetramer, som är ett kraftfullt verktyg för analys av KLRG1 ligander.
Abstract
Killer cell lektin-like receptor G1 (KLRG1) är en typ II transmembrant glykoprotein hämmande receptor som tillhör C-typ lektin-liknande superfamiljen. KLRG1 finns både som monomer och som disulfide-linked homodimer. Denna väl bevarade receptorn finns på de mest mogna och nyligen aktiverade NK-celler samt på en delmängd av effektor / minne T-celler.
Använda KLRG1 tetramer såväl som andra metoder, E-, N-och R-cadherins identifierades som KLRG1 ligander. Dessa Ca2 +-beroende cell-cell adhesionsmolekyler består av en extracellulär domän som innehåller fem cadherin upprepar ansvarig för cell-cell interaktioner, en transmembranös domän och ett cytoplasma domän som är kopplad till aktin cytoskelettet.
Generationen av KLRG1 tetramer var viktigt att identifieringen av KLRG1 ligander. KLRG1 tetramer är också ett unikt verktyg för att belysa de roller cadherin och KLRG1 spela i regleringen av immunförsvaret och vävnaden integritet.
Protocol
Discussion
I detta protokoll, visas det hur man kan rena, biotinylate och tetramerize KLRG1. KLRG1 tetramer kan användas för att märka KLRG1 ligander med flödescytometri. Trots att vika villkor kommer att testas empiriskt för varje protein kan andra C-typ lektiner vara tetramerized med ett liknande protokoll. Använda tetramerized proteiner som prober, ligander till föräldralösa C-typ lektin receptorer skulle kunna identifieras.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Naidenko om hjälp med att optimera vika förhållanden. Detta arbete stöddes av NIH forskningsanslag AI58181 till Laurent Brossay. Cindy Banh stöds av NIH NRSA F31 AI080230.
Stephanie Terrizzi och Cindy Banh bidra lika mycket till detta arbete.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BirA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free | Reagent | Roche | 11 836 170 001 | or equivalent |
| Amicon Stirred Cell | Equipment | Millipore | Model #8400 | or equivalent |
| YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane | Filtration Supply | Millipore | 13642 | |
| 15 ml YM10 concentrator | Filtration Supply | Millipore | 4411 | |
| AKTAFPLC | Equipment | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column | Equipment | GE Healthcare | 17-1166-01 | |
| Strepavidin PE | Reagent | BD Biosciences | 554061 | or equivalent |
References
- Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1. Int Immunol. 19, 391-400 (2007).
- Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1. J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).
- Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity. J Exp Med. 203, 289-295 (2006).
- Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition. Immunity. 31, 35-46 (2009).
- Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1). J Biol Chem. , .
