Preparación ósea descalcificados para histología, histomorfometría y Análisis Fluorocromo
Summary
Histología ósea descalcificados proporciona información importante para una variedad de aplicaciones clínicas y de investigación. Es un desafío técnico, sobre todo con ejemplares de gran tamaño. Este vídeo muestra el proceso de producción de las secciones de buena calidad y demuestra las dificultades técnicas y métodos con los que para superarlos.
Abstract
Histología ósea descalcificados demuestra la microarquitectura del hueso. Muestra tanto los componentes mineralizados y celular del hueso, que proporciona información vital sobre el recambio óseo o formación y resorción ósea. Esto tiene una importancia enorme en una variedad de aplicaciones clínicas y de investigación. Se produce bellas imágenes 1 y permite técnicas tales como la evaluación y el fluorocromo histomorfometría 2. Análisis fluorocromo es una técnica donde los tintes fluorescentes que se unen al calcio se inyectan en un momento determinado punto, lo que permite la cuantificación de la cantidad de mineralización en ese momento dado. Histomorfometría es un proceso de cuantificación de hueso a nivel microscópico.
Realización de la histología del hueso descalcificados es técnicamente difícil, sobre todo con ejemplares de gran tamaño. Se requiere de variaciones en la técnica de los utilizados en parafina estándar integrado histología. Este vídeo muestra el proceso de producción de las secciones de buena calidad y demuestra las dificultades técnicas y métodos con los que para superarlos. La preparación de muestras, fijación y el procesamiento se obtienen con una forma similar a otros tejidos blandos, sin embargo debido a la densidad y baja permeabilidad de los huesos mucho más tiempo de fijación y los tiempos de procesamiento se requieren, a menudo tomando durante varias semanas. Incrustación se logra utilizando un medio de soporte con una dureza similar o igual y la densidad de los huesos, tales como resinas basadas en metacrilato, pero a diferencia de la infiltración de parafina y la inclusión, este es un paso irreversible. Seccionamiento se puede lograr mediante molienda que produce una sección más gruesa, lo cual es óptimo para los estudios como el análisis de fluorocromo. Esto se logra mejor usando una cuchilla de diamante en una macrotome. Por otra parte, las secciones más finas pueden ser producidos por microscopía de luz y esto se logra utilizando un micrótomo de trineo con una cuchilla muy afilada. El microtomo trineo ofrece la mayor resistencia y estabilidad necesaria para los bloques grandes y duras. Resina incrustada secciones se pueden teñir con una variedad de manchas, que se demuestran.
Protocol
Acknowledgements
Los autores desean agradecer la asistencia de la Sra. Sue Connell por su experiencia en la incrustación de resina y tumbas Sra. Stephania por su experiencia de laboratorio. Los autores desean agradecer al profesor Frank Kandziora y la Dra. Marie-Anne Polboth por sus consejos.
Materials
- 10% Normal Buffered Formalin, Ethanol, Xylene and Butanol acid
All histology grade, sulfur free.
Grale Scientific Pty Ltd.
http://www.grale.com.au
- Peel away, plastic moulds
Grale Scientific
- SUPERFROST PLUS Microscope slides
Lomb Scientific Pty Ltd.
http://www.lomb.com.au
- GlycolMethacrylate Technovit 7100
Heraeus Kulzer
http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm - Backing Block Resin- Technovit 3040 Histo block
Heraeus Kulzer
(Reagents from Grale Scientific)
Goldner’s Trichrome stain
1. Weigert’s iron hemotoxylin (DeGroat)
| a) Hemotoxylin solution | |
| Hemotoxylin | 1g |
| Absolute Alcohol | 100mL |
| b) Iron Solution | |
| 30% aqueous ferric chloride | 4mL |
| Hydrochloric acid (concentrated) | 1mL |
| distilled Water | 95mL |
Filtered and added to equal volume of hemotoxylin immediately before stain used.
2. Ponceau-fuchsin-azophloxin stock solutions
| a) Ponceau de xylidine solution | |
| Ponceau de xylidine | 0.75g |
| acid fuchsion | 0.25g |
| Acetic Acid | 1mL |
| mix, and add distilled water (100mL) | |
| b) azophloxin solution | |
| Azophloxin | 0.5g |
| Acetic acid | 0.6mL |
| mix, and add distilled water (100mL) | |
| c) Final working stain solution | |
| Ponceau-fuchsin solution | 5-10mL |
| Azophloxin | 2mL |
| 0.2% acetic acid solution | 88mL |
3. Light Green Solution
| Light Green | 1g |
| acetic acid | 1mL |
| Mix, and add distilled water (500mL) | |
4. Phophomolybdic acid-Orange G solution
| Phosphomolybdic acid | 3g |
| Orange G | 2g |
| Dissolve in 500mL of distilled water and add crystal thymol. | |
Von Kossa Stain
| 1% aqueous silver nitrate |
| 2.5% sodium thiosulfate |
| 1% safranin O |
Alcian blue stain
| Alcian blue 8GX | 1g |
| 3% acetic acid solution | 100mL |
Hemotoxylin and Eosin stain
| a)Harris’s hemotoxylin | |
| Hemotoxylin | 2.5g |
| Absolute alcohol | 25mL |
| Potassium Alum | 50g |
| distilled water | 500mL |
| mercuric oxide | 1.25g OR |
| Sodium iodate | 0.5g |
| Glacial acetic acid | 20mL |
| b) Eosin solution | |
| Commercially produced Eosin was used. | |
All stain dye powders are Gurr dye powders.
All reagents are analytical reagents, and not Lab reagents
Fluorochromes
Manufacturer |
Fluorochrome | Catalogue Number |
| Sigma-Aldrich, Sydney | Calcein Green | C0875 |
| Sigma-Aldrich, Sydney | Alizarin Complexone | A3882 |
| Intervet Australia, Victoria | Oxytetracycline (off the shelf antimicrobial drug) |
Tradename; Engemycin 100 |
References
- Kerr, J. . Atlas of Functional Histology. , 164-168 (2000).
- Parfitt, A. M. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 2, 595-610 (1987).
- An, Y. H., Martin, K. l. . Handbook of histology methods for bone and cartilage. , (2003).
- Bancroft, J. D., Gamble, M. . Theory and Practice of Histological Techniques. , 352-360 (2008).
