Cette vidéo vous montrera comment obtenir des hémocytes (cellules sanguines) de l'Hawaiian calmars bobtail,<em> Scolopes Euprymna</em> Pour une utilisation dans des dosages biologiques et d'adhésion cellulaire bactérienne. Hémocytes seront colorées avec un colorant fluorescent et exposés à la GFP-étiquetée bactéries.
Abstract
Les études concernant le rôle du système immunitaire dans la médiation de la signalisation moléculaire entre les bactéries bénéfiques et leurs hôtes ont, ces dernières années, apporté une contribution significative à notre compréhension de la co-évolution des eucaryotes avec leur microflore. L'association symbiotique entre les calmars Hawaiian Bobtail,<em> Scolopes Euprymna</em> Et la bactérie bioluminescente<em> Vibrio fischeri</em> A été utilisé comme un système modèle pour comprendre les effets des bactéries bénéfiques sur le développement des animaux. Des études récentes ont montré que les macrophages, comme hémocytes, la seule composante innée cellulaire de l'hôte calmar système immunitaire, jouent probablement un rôle important dans la médiation de l'établissement et le maintien de cette association. Ce protocole va montrer comment obtenir des hémocytes de<em> E. scolopes</em> Et ensuite utiliser ces cellules dans des dosages de liaison bactérienne. Adulte calmars sont d'abord anesthésiés avant d'hémolymphe est recueillie par une seringue par le vaisseau sanguin principal céphalique. Les hémocytes hôte, contenues dans l'hémolymphe extraites, sont respectées lamelles de verre cloisonné et ensuite exposés à la protéine fluorescente verte marquée symbiotique<em> Vibrio fischeri</em> Et non-symbiotique<em> Vibrio harveyi</em>. Les hémocytes sont contre avec un colorant fluorescent (Cell Tracker Orange, Invitrogen), puis visualisé par microscopie fluorescente.
Protocol
Préparer 500 ml de 0,22 um, stérilisée par filtration d'eau de mer artificielle (FSW; salinité 35 ppt). Filtre d'eau de mer artificielle ou naturelle à travers un filtre de 0,22 micron um pour éliminer les particules et les bactéries. Anesthetize un adulte Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes) en le plaçant dans une solution à 2% d'éthanol dans FSW. Placez l'animal dans l'anesthésie pendant environ 10 minutes. Le calmar cessera de natation et ne sera pas répondre activement au tou…
Discussion
Les études concernant le rôle du système immunitaire dans la médiation de la signalisation moléculaire entre les bactéries bénéfiques et leurs hôtes ont, ces dernières années, apporté une contribution significative à notre compréhension de la co-évolution des eucaryotes avec leur microflore. Le système squid / vibrion a fait ses preuves en tant que système modèle souple pour répondre aux questions fondamentales dans ce domaine 2,3,5,6,8. La lumière de l'organe de scolopes calm…
Acknowledgements
Les sources de financement: Université du Connecticut Research Foundation et le Département de Biologie Moléculaire et Cellulaire à SVN, Sigma Xi Grant-in-Aid de recherche et Antonio H. et R. Majorie Romano Graduate Education Fellowship pour AJC
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Lab-Tek chambered #1.0 borosilicate coverglass system (8-chambers)
Collins, A. J., Nyholm, S. V. Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria. J. Vis. Exp. (36), e1714, doi:10.3791/1714 (2010).