Мозаика данио рерио трансгенез для оценки Enhancer Последовательности
Summary
Мы демонстрируем наш подход к поиску потенциальных элементов усилителя от умственно регулируемых генов и оценки их функции через мозаику трансгенез рыбок данио.
Abstract
Завершение геноме человека, а также многих других видов, высветил проблемы приписывая определенную функцию, не кодирующих последовательностей. Один известный функция осуществляется без кодирования долю генома состоит в регулировании транскрипции генов, однако, Есть нет эффективных методов широко предсказать цис-регуляторных элементов от первичной последовательности ДНК. Мы разработали эффективный протокол функционально оценки потенциальных цис-регуляторных элементов через данио трансгенез. Наш подход дает значительные преимущества по сравнению с клеточной культуры, основанной методы развивающих важные гены, так как он содержит информацию о пространственной и временной регуляции генов. С другой стороны, это быстрее и дешевле, чем аналогичные опыты на трансгенных мышах, и мы регулярно применять ее к последовательности изолированы от человеческого генома. Здесь мы показываем, наш подход к выбору элементов для тестирования на основе сохранения последовательности и наш протокол для клонирования последовательностей и microinjecting их в данио эмбрионов.
Protocol
Discussion
Мы показали, подход, используемый в нашей лаборатории для эффективного анализа потенциальных усилителей использованием данио трансгенез. Чаще всего мы используем этот подход, чтобы искать тканеспецифические усилители связанные с человеческими генами. Несмотря на отсутствие очевидн…
Acknowledgements
Мы благодарим г-жа Паула Рой за отличную хозяйства рыба, и Стив Ekker для рода даром pDB600 плазмиды. Эти исследования были профинансированы за счет гранта в СФ от NHGRI.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Takara LA Taq | Takara Bio Inc | RR02M | ||
| pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit | Invitrogen | K2500-20 | ||
| Gateway LR Clonase II enzyme Mix | Invitrogen | 11791-100 | ||
| Library efficiency competent cells DH5α | Invitrogen | 12535-019 | ||
| Library efficiency competent cells DB3.1 | Invitrogen | 11782-018 | ||
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1340 | ||
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 |
References
- Fisher, S. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).
- Balciunas, D. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. , (1995).
