דג הזברה פסיפס Transgenesis להערכת רצפים Enhancer
Summary
אנו מדגימים את הגישה שלנו למציאת פוטנציאל משפר אלמנטים מן הגנים מוסדר מבחינה התפתחותית והערכה תפקידם דרך transgenesis דג הזברה פסיפס.
Abstract
השלמת רצף הגנום האנושי, יחד עם זה של מינים רבים אחרים, הדגיש את האתגר של ייחוס תפקיד ספציפי רצפים שאינם קידוד. פונקציה אחת הבולטות שביצעה השבר ללא קידוד של הגנום הוא לווסת את שעתוק הגנים, אולם אין שיטות יעילות רחב לחזות cis-הרגולציה אלמנטים רצף הדנ"א העיקרי. פיתחנו פרוטוקול יעילה מבחינה תפקודית להעריך את הפוטנציאל cis-הרגולציה אלמנטים דרך transgenesis דג הזברה. הגישה שלנו מציעה יתרונות משמעותיים על פני תרבית תאים טכניקות המבוססות על הגנים החשובים מבחינה התפתחותית, שכן הוא מספק מידע על ויסות הגנים במרחב ובזמן. לעומת זאת, הוא מהיר יותר ופחות יקר מאשר ניסויים דומים העכברים הטרנסגניים, ואנחנו שגרתי להחיל אותה על רצפים מבודדים מן הגנום האנושי. כאן אנו מדגימים את הגישה שלנו בחירת האלמנטים לבדיקה המבוססת על שימור רצף פרוטוקול שלנו רצפים שיבוט microinjecting אותם עוברי דג הזברה.
Protocol
Discussion
אנחנו הוכיחו את הגישה בשימוש במעבדה שלנו לניתוח יעיל של משפרי פוטנציאליים באמצעות transgenesis דג הזברה. לרוב, אנו משתמשים בגישה זו כדי לחפש רקמות ספציפיות משפרי הקשורים הגנים האנושיים. למרות חוסר הומולוגיה רצף ברור רוב הזמן בין אדם ודגים ללא קידוד רצפים, אנו מוצאים כי גיש…
Acknowledgements
אנו מודים לגב 'פאולה רועי עבור בעלי דגים מעולה, סטיב Ekker מתנה סוג של pDB600 פלסמיד. מחקרים אלו מומנו על ידי מענק של עד מד"ב מ NHGRI.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Takara LA Taq | Takara Bio Inc | RR02M | ||
| pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit | Invitrogen | K2500-20 | ||
| Gateway LR Clonase II enzyme Mix | Invitrogen | 11791-100 | ||
| Library efficiency competent cells DH5α | Invitrogen | 12535-019 | ||
| Library efficiency competent cells DB3.1 | Invitrogen | 11782-018 | ||
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1340 | ||
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 |
References
- Fisher, S. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).
- Balciunas, D. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. , (1995).
