Mosaic Zebrafisch Transgenese zur Beurteilung Enhancer-Sequenzen
Summary
Wir zeigen unseren Ansatz zur Suche nach potenziellen Enhancer-Elemente aus entwicklungsmäßig regulierten Genen und der Bewertung ihrer Funktion durch Mosaik Zebrafisch Transgenese.
Abstract
Die Fertigstellung des menschlichen Genoms, zusammen mit dem vieler anderer Arten, hat die Herausforderung zuzuschreiben bestimmte Funktion nicht kodierende Sequenzen hervorgehoben. Ein prominenter Funktion von den nicht codierenden Teil des Genoms ist es, Gentranskription regulieren, jedoch gibt es keine wirksamen Methoden, um im Großen und Ganzen vorherzusagen cis-regulatorische Elemente aus primären DNA-Sequenz. Wir haben ein effizientes Protokoll entwickelt, um funktionell zu bewerten potentielle cis-regulatorische Elemente durch Zebrafisch Transgenese. Unser Ansatz bietet erhebliche Vorteile gegenüber Zellkultur-Techniken für entwicklungspolitisch wichtige Gene, da sie Informationen über die räumliche und zeitliche Genregulation bietet. Umgekehrt ist es schneller und kostengünstiger als vergleichbare Experimente in transgenen Mäusen, und wir routinemäßig anwenden, um Sequenzen aus dem menschlichen Genom isoliert. Hier zeigen wir unseren Ansatz zur Auswahl von Elementen für die Prüfung auf der Grundlage Folge Erhaltung und unser Protokoll für das Klonen Sequenzen und Mikroinjektion sie in Zebrafisch-Embryonen.
Protocol
Discussion
Wir haben den Ansatz in unserem Labor für die effiziente Analyse potentieller Enhancer mit Zebrafisch Transgenese verwendet demonstriert. Meistens benutzen wir diesen Ansatz für Gewebe-spezifische Enhancer mit menschlichen Genen assoziiert zu suchen. Trotz des Fehlens von klar Sequenzhomologie die meiste Zeit zwischen Mensch und Fisch nicht-kodierenden Sequenzen, finden wir, dass dieser Ansatz ist in der Regel bei der Identifizierung von Mitteln für die Gene von Interesse, um uns erfolgreich. Die kritischen Faktoren …
Acknowledgements
Wir danken Frau Paula Roy für exzellente Fisch Tierhaltung und Steve Ekker für die Art Geschenk der pDB600 Plasmid. Diese Studien wurden durch einen Zuschuss zur SF aus NHGRI finanziert.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Takara LA Taq | Takara Bio Inc | RR02M | ||
| pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit | Invitrogen | K2500-20 | ||
| Gateway LR Clonase II enzyme Mix | Invitrogen | 11791-100 | ||
| Library efficiency competent cells DH5α | Invitrogen | 12535-019 | ||
| Library efficiency competent cells DB3.1 | Invitrogen | 11782-018 | ||
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1340 | ||
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 |
References
- Fisher, S. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).
- Balciunas, D. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. , (1995).
