향상제 시퀀스를 평가하기위한 모자이크 Zebrafish의 Transgenesis

Summary

우리는 발달 규제 유전자의 잠재적인 확장기 요소를 찾아서 모자이크 zebrafish의 transgenesis 통해 기능을 평가하기 위해 방법을 보여줍니다.

Abstract

많은 다른 종류의와 함께 인간 게놈 순서의 완성, 비 코딩 시퀀스에 특정 기능을 ascribing의 도전을 강조했다. 게놈의 비 코딩 분율에 의해 실시 하나의 두드러진 기능은 유전자 전사를 조절하는 것입니다,하지만, 널리 기본 DNA 시퀀스에서 CIS – 규제 요소를 예측하는 더 효과적인 방법은 없습니다. 우리는 기능 zebrafish transgenesis을 통해 잠재적인 CIS – 규제 요소를 평가하는 효율적인 프로토콜을 개발했습니다. 그것은 공간과 시간적 유전자 조절에 대한 정보를 제공 이후 우리의 접근 방식은, 발달 중요한 유전자에 대한 세포 문화 기반 기술에 비해 상당한 장점을 제공합니다. 반대로, 그것은 빠르고 저렴 유전자 변형 생쥐와 비슷한 실험보다, 우리는 정기적으로 인간 게놈으로부터 격리 시퀀스 프로그램을 적용해야합니다. 여기 복제 시퀀스에 대한 시퀀스 보호 및 프로토콜에 기초하고 zebrafish 배아에 그들을 microinjecting 테스트를위한 요소를 선택하기 위해 방법을 보여줍니다.

Protocol

1. 선택하고 테스트하기위한 보존 시퀀스의 클로닝 하나는 첫번째 기능 테스트를 위해 잠재적인 규제 시퀀스를 식별해야합니다. 우리는 순서를 선택하는 기준으로 진화 순서 보존에 의존하고, 가장 많이 UCSC 게놈 브라우저 (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)에 트랙으로 액세스할 수있는 알고리즘 PhastCons를 사용합니다. 그러나, 수종에 걸쳐 순서 절약을 평가하기 위해 사용할 수있는 여러 가…

Discussion

우리는 zebrafish transgenesis를 사용하여 잠재적인 그때의 효율적인 분석을 위해 저희 실험실에서 사용되는 접근 방식을 증명하고있다. 대부분의 자주, 우리는 인간의 유전자와 연관된 조직 고유의 강화를 찾는이 방법을 사용합니다. 명백한 순서 상동의 부족에도 불구하고 인간과 물고기가 아닌 코딩 순서를, 우리가이 접근 방식이 우리에게 관심의 유전자에 대한 강화를 식별 보통 성공 것을 발견했?…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Takara LA Taq		Takara Bio Inc	RR02M
pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit		Invitrogen	K2500-20
Gateway LR Clonase II enzyme Mix		Invitrogen	11791-100
Library efficiency competent cells DH5α		Invitrogen	12535-019
Library efficiency competent cells DB3.1		Invitrogen	11782-018
mMESSAGE mMACHINE Kit		Ambion	AM1340
HiSpeed Plasmid Midi Kit		Qiagen	12643
QIAquick PCR Purification Kit		Qiagen	28104
Flaming/Brown Micropipette Puller		Sutter Instrument	P-97
Pneumatic PicoPump		World Precision Instruments	SYS-PV820