הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה
Summary
פרוטוקול זה מתאר הדמיה של נוירונים בודדים או תאים הרכס העצבי החיים עוברים דג הזברה. שיטה זו משמשת כדי לבחון התנהגויות הסלולר לוקליזציה אקטין פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות.
Abstract
דג הזברה הוא מודל אידיאלי עבור תא התנהגויות הדמיה במהלך פיתוח in vivo. עוברי דג הזברה הם מופרית חיצונית ולכן נגיש בכל שלבי הפיתוח. יתר על כן, בהירות אופטית שלהם מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים של דינאמיקה מולקולארית בסביבה הטבעית של העובר ללא פגע. אנחנו משתמשים בגישה הדמיה לחיות כדי לנתח את התנהגות התא במהלך נדידת תאים עצביים לפסגה ואת תולדה והכוונה של אקסונים העצבית.
הדמיה חיה שימושית במיוחד להבנת המנגנונים המווסתים תהליכים תנועתיות התא. כדי להמחיש את הפרטים של תנועתיות התא, כגון פעילות ובולטות ודינמיקה מולקולרית, זה יתרון תווית תאים בודדים. בשנת דג הזברה, הזרקת פלסמיד דנ"א התשואות דפוס חולף ביטוי פסיפס מציע יתרונות ברורים על פני שיטות אחרות תיוג התא. לדוגמה, קווי מהונדס לעתים קרובות התווית אוכלוסיות תאים שלמים ובכך עלול לטשטש להדמיה של בליטות קנס (או שינויים בחלוקת מולקולרית) בתא בודד. בנוסף, הזרקה של ה-DNA בשלב אחד התא הוא פחות פולשני ומדויק יותר זריקות צבע בשלבים מאוחרים יותר.
כאן אנו מתארים את שיטת תיוג לפתח נוירונים בודדים או תאים הרכס העצבי הדמיה התנהגותם in vivo. אנו מזריקים פלסמיד דנ"א לתוך 1-תא הבמה עוברי, שתוצאתה ביטוי transgene פסיפס. וקטורים מכילים תאים ספציפיים היזמים כי כונן הביטוי של הגן של עניין משנה של עצב סנסורי או תאים הרכס העצבי. אנו מספקים דוגמאות של תאים שכותרתו עם GFP קרום ממוקד או עם בדיקה biosensor המאפשרת ויזואליזציה של אקטין-F בתאים חיים 1.
אריקה אנדרסן, Namrata Asuri, ומתיו קליי תרם לא פחות לעבודה זו.
Protocol
Discussion
הריכוז האופטימלי של ה-DNA מוזרק ישתנה בהתאם לגודל וכוח של האמרגן לבנות יש לקבוע באופן אמפירי. הזרקה של ה-DNA יותר מדי יכול להוביל עוברים בריאים עם מוות של תאים נרחב, בעוד מעט מדי תגרום חלק קטן מאוד של עוברים מוזרק המבטא את transgene. רמת ביטוי ה-DNA בקורלציה עם חוזק האות fluorophore, א…
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 NS042228 ל MCH FV1000 אולימפוס confocal נרכשה עם מכשור NIH משותף מענק S10RR023717 את המחלקה לזואולוגיה באוניברסיטת וושינגטון (Bement לצרכן ביל).
אריקה אנדרסן, Namrata Asuri, ומתיו קליי תרם לא פחות נייר זה.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | A5040-250G | ||
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 184 | ||
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen Inc. | 12243 | ||
| Low melting point agarose | Invitrogen | 15517-014 | ||
| Picospritzer | Parker Instrumentation, General Valve Division | 051-0302-900 |
References
- Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo. Mech Dev. 120, 211-218 (2003).
- Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones. Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
- O’Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. 24, (2009).
- Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
