Мышиной модели CD40-активации В-клеток

Summary

В этом видео мы продемонстрируем процедуру активации CD40 и расширение мышиных клеток из спленоцитов C57BL / 6 мышей, которые могут быть использованы в качестве модели антиген-представляющих клетки (АПК) для изучения индукции иммунитета.

Abstract

Исследование клеток показало, что CD40 активации улучшает их презентации антигена мощности. При стимуляции с интерлейкина-4 и CD40 лиганда (CD40L), человеческих клеток может быть расширена без трудностей из небольшого количества периферической крови в течение 14 дней до очень большого количества высоко-чистые CD40-лимфоцитов (> 10⁹ Клеток на пациента) от здоровых доноров, а также у больных раком^1-4. CD40-B клетки экспрессируют важно лимфатических узлов самонаведения молекул и может привлекать Т-клетки<em> В пробирке</em⁵. Кроме того, они эффективно заниматься, обрабатывать и представлять антигены Т-клеткам^6,7. CD40-лимфоциты были показаны не только простые наивные, но и расширяют ячеек памяти T^8,9. Поэтому CD40-активированных В-клеток (CD40-лимфоцитов) были изучены в качестве альтернативного источника иммуно-стимулирующего антиген-представляющих клеток (АПК) для клеточной immunotherapy1, 5,10. В целях дальнейшего исследования ли-CD40 В-клеток индуцировать эффективный Т-клеточные реакции в естественных условиях и для изучения основной механизм мы создали систему культуры клеток для создания мышиной CD40-активированных В-клеток. Использование спленоцитов или очищенной В-клеток C57BL / 6 мышей для CD40-активации, оптимальные условия были определены следующим образом: Начиная с спленоцитов C57BL / 6 мышей (гаплотип H-2b) лимфоциты очищают центрифугирования в градиенте плотности и со-культивировали с HeLa клеток, экспрессирующих рекомбинантный мышиный CD40 лиганд (tmuCD40L HeLa)¹¹. Клетки recultured каждые 3-4 дня и ключевые компоненты, такие как CD40L, интерлейкин-4,-меркаптоэтанол и циклоспорин пополняются. В этом протоколе мы покажем, как получить полностью активирована мышиной CD40-лимфоцитов (mCD40B) с аналогичными APC-фенотип человека к CD40-лимфоцитов (рис. 1а, б). CD40-стимуляция приводит к быстрому нарост и расширения высокой чистоты (> 90%), CD19 +-клеток в течение 14 дней культуры клеток (рис. 1в, г). Во избежание загрязнения с неправительственными организациями, трансфицированных клеток, экспрессия мышиного CD40 лиганда на трансфектантов должен находиться под контролем регулярно (рис. 2). Мышиного CD40 активированных В-клеток может быть использована для изучения В-клеточной активации и дифференциации, а также исследовать их потенциал, чтобы функции, как APC в пробирке и в естественных условиях. Более того, они представляют собой перспективный инструмент для создания терапевтических или профилактических прививок против опухолей и поможет ответить на вопросы относительно безопасности и иммуногенности этого подхода¹².

Protocol

Протокол поколение мышиных CD40-активированных В-клеток (mCD40B) из спленоцитов делится на две части: часть демонстрирует подготовку мышиной CD40 лиганда (CD40L), выражающая HeLa клетки (tmuCD40L HeLa), который будет использоваться в качестве пластинчатых связаны фидерных клеток. Часть В описывает факти…

Discussion

Модификации данного протокола возможны, особенно в отношении происхождения CD40-стимул и тип мыши напряжение используется, также уступая в эффективной генерации мышиной CD40-активированных В-клеток. Ахмади соавт. показали аналогичные результаты для мышиных фибробластов, трансфицирован?…

Materials

A. Preparation of Media:

Feeder cell wild type medium	Feeder cell selection medium
Reagent	Concentration	Reagent	Concentration
RPMI 1640		RPMI 1640
L-Glutamine	300 μg/mL	L-Glutamine	300 μg/mL
FBS	10 %	FBS	10 %
HEPES	10 mM	HEPES	10 mM
Gentamycin	15 μg/mL	Gentamycin	15 μg/mL
		Hygromycin B	0.2 mg/mL

mCD40-B washing medium	mCD40-B culture medium
Reagent	Concentration	Reagent	Concentration
D-MEM		D-MEM
L-Glutamine	580 μg/mL	L-Glutamine	580 μg/mL
Glucose	4.5 mg/mL	Glucose	4.5 mg/mL
HEPES	10 mM	HEPES	10 mM
Gentamycin	15 μg/mL	Gentamycin	15 μg/mL
		MEM	0.1mM (1x)
		FBS	10%

B. Miscellaneous Reagents:

Reagent	Company	Order No
RPMI 1640	Invitrogen Gibco®	REF 21875
D-MEM	Invitrogen Gibco®	REF 41965
Dulbecco´s PBS (10x)	PAA	Cat No H15-011
Gencin®	Delta Select	Art No 7395800
FBS	LONZA	Cat No DE14-802C
HEPES Buffer	PAA	Cat No S11-001
MEM NEAA	Invitrogen Gibco®	REF 11140
Hygromycin B	PAA	Cat No P02-015
Recombinant Murine Interleukin-4	Immunotools	Cat No 12340045
Cyclosporin A	Novartis	Cat No NDC 0078-0109-01
Trypsin/EDTA (10x)	Invitrogen Gibco®	REF 15400-054

C. Miscellaneous Supplies:

Reagent	Company	Order No
Sterile pipette tips	Sarstedt
6-well plate	NUNC	Cat No 140675
50mL conical tube	BD Falcon™	Cat No 352070
Tissue culture flask	Sarstedt	Cat No 83.1813.002