Een gedetailleerd protocol is beschreven voor de beeldvorming van de real-time vorming van DNA-herstel complexen in<em> Bacillus subtilis</em> Cellen.
Abstract
Zowel de prokaryoten en eukaryoten te reageren op DNA-schade door een complex geheel van lichamelijke veranderingen. Veranderingen in genexpressie, de herverdeling van bestaande eiwitten, en de assemblage van nieuwe eiwit-complexen kan worden gestimuleerd door een verscheidenheid van DNA-laesies en verkeerde DNA basenparen. Fluorescentie microscopie is gebruikt als een krachtig experimenteel hulpmiddel voor het visualiseren en te kwantificeren deze en andere reacties op DNA laesies en DNA-replicatie-status te controleren binnen het complex subcellulaire architectuur van een levende cel. Translationele fusies tussen fluorescerende reporter eiwitten en componenten van de DNA-replicatie en reparatie machines zijn gebruikt om de signalen te bepalen die zich richten op DNA-reparatie eiwitten aan hun verwante letsels<em> In vivo</em> En om te begrijpen hoe deze eiwitten worden georganiseerd in bacteriële cellen. Daarnaast zijn transcriptionele en translationele fusies gekoppeld aan DNA-schade induceerbare promoters geopenbaard die cellen binnen een populatie hebben genotoxische stress respons geactiveerd. In deze review, bieden we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van fluorescentiemicroscopie het imago van de assemblage van DNA-reparatie en DNA-replicatie complexen in enkele bacteriële cellen. In het bijzonder dit werk richt zich op beeldvorming mismatch repair eiwitten, homologe recombinatie, DNA-replicatie en een SOS-induceerbare eiwit in<em> Bacillus subtilis</em>. Alle hier beschreven procedures zijn gemakkelijk vatbaar voor beeldvorming eiwitcomplexen in een verscheidenheid van bacteriële soorten.
Protocol
Groeiende culturen van cellen voor microscopie 1. Een of twee dagen voor de beeldvorming, de voorbereiding van de B. subtilis stam die het translationele fusie-eiwit u wenst te visualiseren. Trial rondes van de stappen 1A en 1B zal nodig zijn om te bepalen welke groei de conditie van de beste beelden van je stam biedt. In de meeste gevallen, moeten cellen worden afgebeeld tijdens de exponentiële groei fase. Voor sommige B. subtilis stammen (in het…
Discussion
Trial and error zijn verplicht om de blootstelling voorwaarden te vinden voor de hoogste kwaliteit beelden voor elke stam, vinden we dat een milliseconde is geschikt voor wit licht beelden, terwijl de blootstelling van 100 tot 2000 ms zijn geschikt voor GFP (FITC) en FM4-64 (TRITC ) beelden. Belichtingstijd is afhankelijk van de gebruikte beeldvormende apparatuur. Wij raden het gebruik van een stam per 15-well microscoop glijbaan voor de eenvoudigste beeldvorming, als pad de kwaliteit en de verspreiding van cellen van h…
Acknowledgements
De auteurs willen Drs bedanken. Philina S. Lee en Alan D. Grossman voor de eerste training LAS in fluorescentie microscopie. De auteurs danken ook Drs. Melanie Berkmen en Hajime Kobayashi voor hulp en tips voor beeldvorming. Dit werk werd ondersteund door start-up middelen van de College of Literature, Science & Kunst en van de afdeling Moleculaire, Cellular, en Ontwikkelingsbiologie aan de Universiteit van Michigan.
Materials
Specific solution recipes1:
10x S750 salts
0.5 M MOPS
100 mM Ammonium Sulfate
50 mM Potassium Phosphate Monobasic
Filter sterilize, and wrap S750 media in foil prior to storage
100x Metals
0.2 M MgCl2
70 mM CaCl2
5 mM MnCl2
0.1 mM ZnCl2
100 μg/mL Thiamine HCl
2 mM HCl
0.5 mM FeCl3*
dH2O to final volume
*FeCl3 should be added last, to prevent precipitation.
After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil.
S750 media
1x S750 salts
1x Metal
1% Glucose
0.1% Glutamate
40 μg/mL Tryptophan
40 μg/mL Phenylalanine
distilled H2O to final volume
10x Spizizens (grams/L)
151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L)
803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L)
440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L)
34.0 mM Sodium Citrate (10g/L)
16.6 mM MgSO4 (2g/L)
dH2O to final volume
Filter sterilize
Klocko, A. D., Crafton, K. M., Walsh, B. W., Lenhart, J. S., Simmons, L. A. Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (36), e1736, doi:10.3791/1736 (2010).