Method Article

이미징 불일치 복구 및 DNA의 손상 세포 응답 바실러스 subtilis

DOI:

10.3791/1736

⸱

February 8th, 2010

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan-Ann Arbor

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

자세한 프로토콜은 이미징을 위해 DNA 수리 단지의 실시간 형성을 설명 바실러스 subtilis 세포.

Abstract

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모두 prokaryotes와 eukaryotes는 생리적 변화 복잡한 설정을 통해 DNA 손상에 대응. 유전자 표현, 기존의 단백질의 재배포, 새로운 단백질 단지의 어셈블리에 변경이 DNA의 병변과 일치하지 않는 DNA 기본 쌍 다양한 자극에 의​​해 수 있습니다. 형광 현미경은 DNA의 병변과 살아있는 세포의 복잡한 subcellular 구조 내의 DNA 복제 상태를 모니터링하기 위해 이러한 행위나 기타 가능한 답변을 시각화하고 quantifying을위한 강력한 실험 도구로 사용되고 있습니다. 형광 기자 단백질과 DNA 복제 및 복구 기계의 구성 요소 사이의 Translational fusions는 단서를 결정하는 데 사용되었다는 그들의 동족의 병변을 대상 DNA 수리 단백질

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

현미경에 대한 세포의 성장 문화

1. 하루나 이틀 전에 영상에, B. 준비 subtilis는 시각화하려는 translational 융합 단백질을 포함하는 변형. 단계 1A와 1B의 평가판 반올림 성장 상태가 변형 최고의 영상을 제공하는 결정하기 위해 필요합니다. 대부분의 경우, 세포는 지수 성장 단계에서 몇 군데해야합니다.

  1. 일부 B. 들어 subtilis의 변종 (때문에 그 내생 로커스에 관심과 GFP의 유전자 사이의 translational 융합의 통합이 저조한 성장 특히, 종자)를, 이전 이미지로 이틀 동안 초기 성장은 높은 품질의 이미지가 필요합니다. 첫 날, 승리 B. subtilis는 선택적 항생제 (S)와 LB 한천에 몇 군데로 부담하고 30 ° C.에 밤새 품어 두 번째 날, 하나의 식민지와 0.85 %의 식염수 100 μl를 예방하고 30 하룻밤 배양하여 다음 각 희석 100 μL를 도금 LB 한천 플레이트 세 10 배 시리얼 dilutions (선택적 항생제), ° C. 수행 셋째 날, 세포의 빛을 합류 성장과 희석 접시를 선택합니다. 접시에 라이트 합류 성장 가능성 (4 단계 참조) 우수한 이미징 결과를 얻을 수....

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

시행 착오는 각 변형에 대한 최고 품질의 이미지에 대한 노출 조건을 찾을 필요, 100-2000 MS의 노출은 GFP (FITC)와 FM4 - 64에 적합한 반면 우리는 1 밀리초는 하얀 빛을 이미지에 적합한 것을 발견 (TRITC ) 이미지. 노출 시간은 사용되는 이미징 장비에 따라 달라집니다. 여러 변종이 동일한 슬라이드에있는 경우에는 패드 국경에서 세포의 패드 품질과 확산은 스트레인 차별 복잡있을 수 있기 때문에 우리는 가장 간단한 영상 15 - 잘 현미경 슬라이드 당 하나의 변형의 사용을 권장합니다. 이미지 품질을 직접 박테리아가 휴식하는 아가로 오스 패드의 품질에 따라 달라집니다. 박테리아가 나란히 위치를 최고 품질의 이미지는 아가로 오스 패드에서 캡쳐한 것입니다. monolayer 방지, 클럼프에 박테리아 세포의 원인이 패드는, 가난한 이미지를 생성합니다. 탈수 아르 패드가 제대로 휴식 세포를 허용하지 않습니다 반면 너무 두께 패드는 높은 배경 형광 신호를 생산합니다. 이 아가로 오스 패드 결함은 일반적으로 매우 좋.......

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Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자 DRS 감사하고 싶습니다. 처음 형광 현미경으로 마이크로 훈련을위한 Philina S. 리 앨런 D. 그로스맨. 저자는 또한 DRS 감사합니다. 도움말 및 팁 이미징 용 멜라니 Berkmen와 하지메 고바야시. 이 작품은 문학, 과학 예술 대학에서와 미시간 대학에서 분자 세포 및 발달 생물학의학과에서 자금 업을 시작하여 지원했다.

....

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Materials

특정 솔루션 조리법 1 :

10X S7 50 염
0.5 M의 맙스
100 MM의 질산 황산
50 MM 인산 칼륨 일염기의
소독 필터, 사전 스토리지 포장 S7 박 50 미디어

100x 금속
0.2 M MgCl 2
70 MM CaCl 2
5 MM MnCl 2
0.1 MM ZnCl 2
100 μg / ML 티아민 HCL
이 MM HCL
0.5 MM FeCl 3 *
최종 볼륨 DH 2 O
* FeCl 3 석출을 방지하기 위해, 마지막으로 추가되어야합니다.
호일에 필터 살균 후, 랩 100x 금속 솔루션입니다.

S7 50 미디어
1X S7 50 염
1X 메탈
1 % 포도당
0.1 %의 글루 탐 산염
40 μg / ML 트립토판
40 μg / ML 페닐알라닌
최종 볼륨에 소주 H 2 O

10X Spizizens (g / L)
151.4 MM의 질산 황산 (20g / L)
803.8 MM 인산 칼륨 일염기의 (140g / L)
440.9 MM 인산 칼륨 이염 (60g / L)
34.0 MM 나트륨 구연 산염 (10g / L)
16.6 MM MgSO 4 (2g / L)
최종 볼륨 DH 2 O
소독 필터

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).
  2. Berkmen, M. B., Grossman, A. D. Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle. Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).
  3. Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C.

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Bacillus subtilisDNA Mismatch RepairFluorescence MicroscopyGFP Translational FusionsProtein Complex ImagingSOS Inducible ProteinHomologous RecombinationDNA ReplicationMembrane Staining FM 4 64Agarose Pad Preparation

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