붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 세포 면역 반응의 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법의 분석
Summary
우리는 총뿐만 아니라 붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 CD4 +와 CD8 + T 세포, HIV / AIDS 백신 연구를위한 이상적인 모델의 메모리 하위 집합에 대한 자세한 phenotypic와 기능 특성에 대한 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법의 유틸리티를 보여줍니다.
Abstract
붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이 모델은 현재 백신 및 치료제의 개발을위한 최상의 사용할 수있는 pathogenesis을 이해와 관련하여 HIV – AIDS에 대한 모델뿐 아니라<sup> 1,2,3</sup>. 여기, 우리는 세포 면역 반응에 대한 자세한 phenotypic 및 기능 분석, CD4 세포에 의해 구체적으로 시토킨 생산 +와 CD8 + T 세포뿐만 아니라 개별 메모리 하위 집합에 대한 방법을 설명합니다. 우리는 모두 CD4에서 인터페론 감마의 생산에 대한 정확한 양적 및 질적 조치 (INF -)와 인터루킨 (IL) -2를 취득 +와 CD8 + T PMA 플러스 ionomycin (PMA + I)를 자극 붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이 PBMC에서 세포. 시토킨 프로파일 메모리 세포의 서로 다른 하위 집합에서 다른되었습니다. 또한,이 프로토콜은 항원 특정 CD4의도 작은 분수를 입증하기 위해 우리에게 감도를 제공하는 +와 CD8 + 우리 연구실에서 개발된 HIV 봉투 펩타이드 칵테일 백신과 예방 접종을 붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이에서 PBMC 샘플 내의 T 세포 집합. 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법 기술 정확하게 T 세포의 다른 인구를 식별하는 강력한 도구입니다<sup> 4,5</sup> 시토킨 생산 기능이있는<sup> 6</sup> 불특정 또는 특정 항원 자극에 따라<sup> 5,7</sup>.
Protocol
1) 셀 준비와 antigenic의 자극, 2) 표면 마커 얼룩, 3) 세포 시토킨 얼룩과 4) 유동세포계측법 : 총뿐만 아니라 T 세포의 메모리 하위 집합의 세부 phenotypic 및 기능 분석에 대한 절차는 네 부분으로 나눌 수 분석합니다. 1. 세포 준비와 antigenic의 자극 두 신선하게 격리뿐만 아니라 cryo 보존된 말초혈 mononuclear 세포 (PBMC)가이 프로토콜에 사용되었습니다. PBMC는 Ficoll – Hypaque (His…
Acknowledgements
짧은 꼬리 원숭이 혈액과 PBMC 샘플 박사 프라 모드 Nehete 부부 바티 Nehete,이 작품은 부분적으로 NIH 부여 AI 46,969의 자금에 의해 지원되었고, 모든 세포 배양 매체는 중앙 미디어 연구소에 의해 생산되었다, NIH 부여 CA에 의해 자금 지원됩니다 16672.
Materials
Solution and Buffers
- Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- RPMI-1640 medium (HyClone laboratories, Logan, UT)
- Fetal Bovine Serum (FBS), (HyClone laboratories, Logan, UT)
- L-glutamine (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
- Penicillin/streptomycin (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- Trypan blue reagent (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
- 50 mM Tris, PH 8.6; filtered and store at 4°C
- Dulbecco’s PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free; Life technologies, Rockville, MD)
- Flow wash buffer: DPBS supplement with 2% FBS, store at 4°C
- BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Biosciences; San Jose, CA)
Activation agents
- Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Ionomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Costimulatory mAb CD49d, clone 9F10 (BD Biosciences; San Jose, CA)
- Affinity purified antibody F (ab )2 fragments of Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (Kierkegaard and Perry Laboratory, Gaithersburg, MD)
- Specific activation agents could include peptide pools, single peptide, or whole protein
Cytokine secretion inhibitors
- Brefedin A (BFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Golgi Plug can be used alternatively (BD Biosciences; San Jose, CA)
Antibodies
- Live/dead fixable aqua fluorescent stain kit (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD4 pacific blue (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA)
- CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD28 PerCP-cy5.5 (L293), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD95 APC (DX2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- IFN- FITC (B27), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- IL-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences; San Jose, CA)
References
- Ogg, G. S. Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science. 279, 2103-2106 (1998).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68, 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68, 4650-4655 (1994).
- Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque. Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).
- Pitcher, C. J. Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque. J Immunol. 168, 29-43 (2002).
- Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).
- Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes. J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).
- Gauduin, M. C. Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques. J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).
- De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 1. 1. -. c. o. l. o. r. 13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity. Nat Med. 7, 245-248 (2001).
- Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data. Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).
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Cite This Article
He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques. J. Vis. Exp. (38), e1743, doi:10.3791/1743 (2010).