ניתוח מקיף של ההלחנה קירות התא הצומח (ביומסה Lignocellulosic) חלק א: ליגנין

Summary

ביומסה הצמח הוא משאב מרכזי פחמן ניטרלי מתחדשת שיכול לשמש לייצור דלק ביולוגי. ביומסה הצמח מורכב בעיקר קירות התא, חומר מרוכב מורכבות מבנית כינה lignocellulosics. כאן אנו מתארים פרוטוקול לניתוח מקיף של התוכן הרכב ליגנין polyphenolic.

Abstract

הצורך מתחדשת, פחמן ניטרלי, וחומרי גלם לתעשיית קיימא והחברה הפכה להיות אחד הנושאים הדחופים ביותר של המאה ה -21. זה לעורר עניין מחדש השימוש במוצרים צמח כחומרי גלם לייצור תעשייתי של דלק נוזלי לתחבורה¹ ומוצרים אחרים כגון חומרי biocomposite⁷. ביומסה הצמח נשאר אחד שלא נוצל שומרת לעצמה הגדולה ביותר על פני כדור הארץ⁴. היא מורכבת בעיקר של קירות התא מורכב של פולימרים אנרגיה עשיר כולל תאית, hemicelluloses שונים (סוכרים מטריקס, ואת ליגנין פוליפנול⁶ ולכן נקראת לפעמים lignocellulosics. עם זאת, קירות תא הצמח התפתחו להיות סרבן השפלה כמו קירות לספק חוזק מתיחה לתאים הצמחים כולו, להדוף פתוגנים, ולאפשר למים להיות מועבר ברחבי המפעל, במקרה של עצי עד יותר מ 100 לעיל הקרקע. בשל הפונקציות השונות של קירות, קיים מגוון עצום מבניים בתוך חומות של מיני צמחים שונים, סוגי תאים בתוך מפעל יחיד⁴. לפיכך, בהתאם למה מינים היבול, מגוון הצומח, או רקמות הצמח משמש biorefinery, מדרגות עיבוד depolymerization על ידי תהליכים כימיים / אנזימטית ותסיסה הבאים של סוכרים שונים דלקים נוזליים צריך להיות מותאם אופטימיזציה. עובדה זו בבסיס הצורך אפיון יסודי של feedstocks ביומסה הצמח. כאן אנו מתארים מתודולוגיה אנליטית מקיפה המאפשרת קביעת הרכב lignocellulosics והוא מקובל בינוני ניתוח תפוקה גבוהה. בחלק ראשון זה אנו מתמקדים בניתוח של ליגנין פוליפנול (איור 1). השיטה של ​​מתחיל עם הכנת חומר destarched דופן התא. Lignocellulosics וכתוצאה מכך הם התפצלה כדי לקבוע את התוכן שלו על ידי ליגנין solubilization acetylbromide³ ו ליגנין הרכב שלה במונחים של יחידות שלה syringyl guaiacyl ו-p-hydroxyphenyl⁵. פרוטוקול לניתוח הפחמימות ביומסה lignocellulosic לרבות תוכן תאית פוליסכריד הרכב מטריצה ​​נדון חלק II².

Protocol

1. קיר בידוד נייד טוחנים בערך 60-70mg של אוויר או חומר להקפיא מיובש צמח עם 5.5 מ"מ נירוסטה כדורי פלדה צינורית 2 מ"ל בורג מכסה Sarstedt באמצעות iWall, רובוט שחיקה מחלק (30 י). החלופה הלא רובוטית נמוך התפוקה ההליך באמצעות כדור הטחנה (retschmill) מוצג חלק II 2. הוסף 1.5 מ"ל של אתנול מימית 70% לחומר הקרקע לוותר, והמערבולת ביסודיות. צנטריפוגה בסל"ד 10,000 עבור 10 דקות עד גלולה שאריות אלכוהול מסיס. לשאוב או למזוג supernatant. הוסף 1.5 מ"ל של כלורופורם פתרון / מתנול (01:01 v / v) כדי שאריות ולנער צינור ביסודיות כדי resuspend גלולה. צנטריפוגה בסל"ד 10,000 עבור 10 דקות ו לשאוב או למזוג supernatant. Resuspend גלולה ב 500 μl של אצטון. להתאדות הממס עם זרם של אוויר ב 35 ° C עד יבש. אם דגימות מיובשות הצורך ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר, עד לעיבוד נוסף. כדי ליזום את הסרת עמילן מן המדגם resuspend את הכדור בתוך 1.5 מ"ל של 0.1 נתרן אצטט M חיץ pH 5.0. שווי הצינורות Sarstedt וחום במשך 20 דקות. בשעה 80 ° C בבלוק חימום. מצננים את ההשעיה על הקרח. מוסיפים את סוכני הבאים אל גלולה: 35 μl של 0.01% אזיד הנתרן (NaN3), עמילז 35 μl (50 מיקרוגרם / מ"ל H 2 O; ממינים Bacillus, Sigma); 17 pullulanase μl (17.8 יחידות מ acidopullulyticus Bacillus: Sigma) . שווי הצינור ואת המערבולת ביסודיות. ההשעיה היא מודגרות מעל בלילה 37 מעלות צלזיוס ב שייקר. מכוונת את הצינורות אופקית משופרת עוזרים ערבוב. ההשעיה מחממים ב 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות בתוך גוש חימום לסיים את מערכת העיכול. צנטריפוגה (10,000 סל"ד, 10 דקות) וזורקים supernatant solubilized המכיל עמילן. שטפו את הנותרים גלולה שלוש פעמים על ידי הוספת 1.5 מ"ל מים, vortexing, centrifuging ו decanting מים הכביסה. Resuspend גלולה ב 500 μl של אצטון. להתאדות הממס עם זרם של אוויר ב 35 ° C עד יבש. זה עשוי להיות נחוץ גם כדי לשבור את החומר בתוך הצינור עם מרית לייבוש טוב יותר. חומר יבש מציג דופן התא המבודד (lignocellulosics). אם דגימות מיובשות הצורך ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר, עד לעיבוד נוסף. 2. ליגנין תוכן שיטה זו מבוססת על שיטת שדווחו על ידי Fukushima ו הטפילד 3. לשקול 1-1.5 מ"ג של חומר התא מוכן קיר (ראה 1) לתוך הבקבוק 2 מ"ל נפח עוזב אחד שפופרת ריק ריק. לשטוף עם צינור קירות 250 μl של אצטון כדי לאסוף את דופן התא חומר על החלק התחתון של הצינור, להתאדות אצטון מאוד עדין תחת זרימת האוויר. בעדינות להוסיף 100 μl של פתרון טריים ברומיד אצטיל (25% v / v ברומיד אצטיל חומצה אצטית קרחונית) לאורך קירות הצינור כדי למנוע התזה. שווי נפח בקבוק חום של 50 מעלות 2hrs מחממים במשך שעה נוספת עם vortexing כל 15 דקות. מצננים על הקרח לטמפרטורת החדר. הוסף 400 μl של סודיום הידרוקסיד 2M ו 70 μl של המוכן טרי hydrochloride 0.5 hydroxylamine ז. וורטקס volumetric צלוחיות. מלאו את הבקבוק volumetric בדיוק על 2.0 מ"ל סימן עם חומצה אצטית כובע קרחונים, וכן להפוך מספר פעמים כדי לערבב. פיפטה 200 μl של התמיסה לתוך צלחת UV 96 ספציפי היטב לקרוא קורא ELISA ב 280nm. לקבוע את אחוז ליגנין ברומיד אצטיל מסיסים (% ABSL) באמצעות מקדם המתאים (צפצפה = 18.21; העשבים = 17.75; ארבידופסיס = 15.69) עם הנוסחה הבאה: % ABSL Calc: כפל של ABSL% עם 10 תוצאות יחידת UG / מ"ג דופן התא זה עוזר לעשות לפחות 3 צלחת קורא לממוצע ספיגת (ABS) מאז חלקיקים יכול לגרום שינוי קל ספיגת ערכים. הערה: 0.539 ס"מ מייצג את pathlength, אבל תלוי על הצלחת זה אולי צריך להיות נחוש. 3. ליגנין הרכב שיטה זו אומצה משיטת שפורסם לאחרונה על ידי רובינסון מנספילד 5. העברת כ 2 מ"ג של החומר דופן התא (ראה 1.) לתוך צינור בורג כתרים זכוכית thioacidolysis. בזהירות להכין trifluoride 2.5% בורון diethyl etherate (BF 3), 10% ethanethiol (EtSH) פתרון. עליך להשתמש בלון מלא גז חנקן כדי לתפוס את אובדן הנפח בבקבוק dioxane עם חנקן. Dioxane מסוכן מאוד, לא לוקחים דגימות או ציוד מתוך מכסה המנוע. כרכים הדרוש להכנת הפתרון לפי המדגם: 175 μl dioxane; 20 EtSH μl; 5 BF μl 3. הוסף 200 μl של EtSH, BF 3, פתרון dioxane לטעום כל אחד. בקבוקון הטיהור אמיץ עם גז חנקן כובע מיד. מחממים ב 100 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות עם שעה עדין כל ערבוב. סוף תגובה על ידי קירור על הקרח במשך 5 דקות. הוסף 150 μl של סודיום ביקרבונט 0.4M, מערבולת בשביל לנקות להוסיף 1 מ"ל מים 0.5 מ"ל של אתיל אצטט מערבולת, ולתת שלבים נפרדים (אתיל אצטט על המים העליונה, על התחתונה). העברת 150 μl של שכבת אתיל אצטט לתוך צינור 2 Sarstedt מ"ל. ודא שאין מים מועבר. להתאדות ממס על ידי concentrator עם האוויר. הוסף 200 μl אצטון ו להתאדות (לחזור על סך של שתי פעמים להסיר עודפי מים). עבור derivatization TMS להוסיף 500 μl של אתיל אצטט, 20 μl של פירידין, ו 100 μl של N, O-bis (trimethylsilyl) acetamide אל צינור אחד. דגירה במשך 2 שעות במהירות של 25 ° C. העברת 100 μl של התגובה לתוך בקבוקון GC / MS ולהוסיף 100 μl של אצטון. ניתוח דגימות על ידי GC מצויד ספקטרומטר מסה-quadrupole או יינון גלאי להבה. טור HP-5ms Agilent מותקן (30 מ"מ X 0.25 X 0.25 מ"מ עובי הסרט מיקרומטר). מפל הטמפרטורה הבא נמצא בשימוש עם השהיה של 30 דקות ממס של 1.1 מ"ל / דקה ספיקה: להחזיק ראשוני ב 130 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות, 3 ° C / min כבש ל 250 מעלות צלזיוס והחזק דקות 1; לאפשר איזון הטמפרטורה ההתחלתית של 130 ° C. פיקס מזוהים פעמים החזקת קרוב משפחה באמצעות tetracosane פנימי סטנדרטי (לא חובה) או על ידי הקשת מאפיין יונים המונית של 299 מ '/ z, 269 מ' / z, ו – 239 מ '/ z עבור S, G ו-H מונומרים, בהתאמה (ראה איור. 2). הרכב של רכיבים ליגנין היא לכמת ידי הגדרת אזור שיא בסך הכל 100% 4. נציג תוצאות דוגמה של ניתוח קיר מוצג באיור 2. במקרה זה צפצפה גזע (עץ) נותח על ידי נהלים שונים המתוארים בסעיף פרוטוקול. Chromatogram דוגמה הפרדת ליגנין רכיבים לאחר thioacidolysis ו-TMS derivatization מוצג. ברור, השפע היחסי של syringyl-(S), guaiacyl-(G), ו-p-hydroxyphenol (H) היחידות ניתן לקבוע. התוכן של ליגנין ברומיד אצטיל מסיסים הוא מובן מאליו, יש לצפות לערכים של בין 20-50% ממשקל קיר יבש. יש לציין כי ברומיד אצטיל לא solubilize כל ההווה ליגנין בקיר, וכי מידת solubilization יכול להשתנות בהתאם החומר. עם זאת, שיטה זו היא קלה יחסית לביצוע ומהירה והוא נותן קירוב מצוין של התוכן ליגנין בחומר lignocellulosic. איור 1:. סקירה כללית של ניתוח lignocellulosic קירות התא (lignocellulosics) מבודדים מן החומר הגולמי צמח מיובש. החומר הקיר משוקלל מכן לתוך aliquots ו לחלק את מבחני שונות. חומר וול מטופל עם ברומיד אצטיל ואת ליגנין solubilized לכמת ידי ספקטרוסקופיה-UV. לקביעת הרכב ליגנין, חומר הקיר נתונה thioacidolysis. Phenolics solubilized לעבור derivatization TMS ולאחר מכן יכול להיות מופרדים לכמת ידי ניתוח GC-MS. הרכב פוליסכריד מטריקס פרוטוקול גבישי תוכן תאית נדון בחלק ב '2. איור 2:. Lignocellulosic ניתוח מקיף של עץ צפצפה שבבי עץ של צפצפה (Populus tremoloides) נחשפו הפרוטוקולים תיאר. Ligin הרכב; H p-hydroxyphenyl; G guaiacyl; S יחידות syringyl.

Discussion

השיטות שתוארו לאפשר הערכה כמותית מהירה של תוכן ליגנין והרכב של ביומסה הצמח lignocellulosic. השימוש ברובוט iWall כ 350 דגימות הקרקע ניתן לוותר ליום. התפוקה של שיטות אנליטיות שונות לאדם משתנה. שימוש בפרוטוקולים המתואר כאן, 30 דגימות יכול להיות מעובד על תוכן ליגנין, ו -15 עבור הרכב ליגנין ליום. בשל אופיו הכמותי של הגידולים אופטימלי נתונים חומרי גלם, מגוון או גנוטיפים ניתן להעריך מבחינת התאמתם לייצור דלק ביולוגי.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Hydroxylamine Hydrochloride		Sigma-Aldrich	255580
Acetyl Bromide		Aldrich	135968
Ethanethiol		Sigma-Aldrich	E3708
Borontrifluoride diethyl etherate		Fluka	15719
N,O,-Bis(trimethylsilyl) acetimide		Fluka	15241
Dioxane		Sigma-Aldrich	296309
Spectromax Plus 384		Molecular Devices	Plus384
GC-MS		Agilent	6890 GC/5975B MSD	(lignin composition)
5.5mm Stainless Steel Balls		Salem Ball Company	(N/A)
96 well plate heat spreader		Biocision	Coolsink 96F
Heating block		Techne	Dri-block DB-3D
Sample concentrator		Techne	FSC400D