체관부 및 로블롤리 파인에서 목부 등 많은 식물 조직 ( 피너스 taeda L.), phenolics 및 RNA 정화 방해 다당류의 높은 수준을 포함합니다. 이 프레 젠 테이션 현장 성장 조직 및 microarrays 및 기타 게놈 분석을위한 충분한 품질의 RNA의 분리의 수확 방법에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
조직은 로블롤리 파인로 특히 침엽수 종, Pinaceae 가족에 속한 사람 (격리
프로토콜
1 부 : 트리 하베스트
나무를 선택하고 넘어가는되면 그것은 신중하게 최대한 신속하게 작업하는 것이 중요합니다. 각기 다른 조직 유형이 수확이므로 시료 물질의 교차 오염을 피하기 위해, 그들은 자신의 액체 질소 용기에 즉시 배치해야합니다. 이 RNA 격리 프로토콜은 확장성입니다.
- 약 0.5-0.75 m의 길이로 볼트를 잘라 전기톱 점수와 두 개 또는 세 곳에 껍질은 볼트의 세로축을 따라.
- 껍질 그것이 줄기에서 완전히 분리까지 나무에서 별도의 껍질 부분에 다시 당기면서 정을 작업을 계속하기 시작 때까지 나무 치즐 사용하여 점수 영역의 가장자리를 작동합니다.
- 보조 목부는 껍질 벗겨지고되었습니다 볼트의 길이 방향 축을 따라 스크레이핑하여 직선 가장자리, 단일 양면 레이저와 수확이다. 조직의 오염을 최소화하기 위해 라텍스 장갑을 착용한다.
- 껍질 섹션의 안쪽에 위치한 체관부는, 쉽게 필링 매뉴얼에 의해 수확이다.
- 반응 나무는 존중 땅에 그들의 원래 방향을 표시하는 스프레이 페인트를 표시한 다음 사지의 아래쪽에서 수집됩니다.
- 팔다리는 1-2미터의 볼트로 잘라 반응 나무의 두 가지 유형의 대략적인 위치에 따라 세로 축을 따라 반....
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토론
침엽수 종에서 고품질의 RNA를 구하기 우디 조직에서 발견 페놀 수지 carbon와 다당류 화합물의 높은 수준을 주어 어려운 작업이 될 수 있습니다. 장 외 개발한 프로토콜로 시작. (1), 우리는 더 엄격한 추출을 발견하고 침엽수 종의 다양한에서 샘플 다양한 우디 및 비 - 우디 조직에서 매우 높은 품질의 총 RNA의 일관된 고립으로 이어질 단계를 정리했습니다. 이 비디오는 우리 수정된 RNA 격리 프로토콜뿐만 아니라 필드 수집 및 절연 RNA하기 전에 로블롤리 파인에 사용되는 처리 기술에서 촬영된 단계뿐만 아니라 증명했다. 이러한 수확 및 준비 단계는 현장에서 수집된 샘플 RNA의 저하를 최소화하기 위해,뿐만 아니라 RNA의 품질과 총 생산량 모두 증가 똑같이 중요합니다. 가장 중요한, 우리는 RNA가 PtGen2 로블롤리 소나무 microarray (2)에 대한 하이브 리다이 제이션에 대한 microarray 목표를 준비하는 데 사용되는 다른 방법에 비해 cDNA 합성 수율을 증가하게되었다이 방법을 사용하여 준비 것으로 .......
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감사의 글
닥터 조 나이른, 매트 Bryman, 마이클 보르도, Ujwal Bagal, Huizhe 진, 아만다 Bouffier : 우리는 누구의 도움이 소나무 조직의 수집이 가능 않았을 텐데하지 않고 다음 사람에게 감사를 표합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| RNA 분리 버퍼 | 2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine | ||
| 클로로포름 | Fisher Scientific | C298-4 | |
| 페놀, 초고순도 | Invitrogen | 15509-037 | |
| 10M LiCl | DEPC 처리수로 제조 | ||
| SSTE 버퍼 | 1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0) | ||
| Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8 | DEPC 처리수로 제조 | ||
| 페놀-클로로포름 (pH8.0) | 120mL 페놀, 160mL 클로로포름을 0.5M Tris-Cl pH 8.0으로 여러 번 적정하여 제조 | ||
| Oak Ridge 고속 테플론 튜브 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #05-562-16B | |
| 폴리프로필렌 50mL 고속 튜브 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #05-562-10K | |
| BD Falcon, 멸균, 캡 포함 50mL 원추형 일회용 튜브 | VWR international | #21008-939 | |
| Phase Lock Gel Heavy, 2mL | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #2302830 | |
| Ambion RNase-free 마이크로 원심분리 튜브, 2mL | Ambion | #AM12425 |
참고문헌
- Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).
- Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Siműes, M., Dean, J. F. D. Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microar....
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