로블롤리 파인로부터 RNA 분리의 개선 방법 ( P. taeda L.) 및 기타 코니퍼 종

Summary

체관부 및 로블롤리 파인에서 목부 등 많은 식물 조직 ( 피너스 taeda L.), phenolics 및 RNA 정화 방해 다당류의 높은 수준을 포함​​합니다. 이 프레 젠 테이션 현장 성장 조직 및 microarrays 및 기타 게놈 분석을위한 충분한 품질의 RNA의 분리의 수확 방법에 대해 설명합니다.

Abstract

조직은 로블롤리 파인로 특히 침엽수 종, Pinaceae 가족에 속한 사람 (격리

Protocol

1 부 : 트리 하베스트

나무를 선택하고 넘어가는되면 그것은 신중하게 최대한 신속하게 작업하는 것이 중요합니다. 각기 다른 조직 유형이 수확이므로 시료 물질의 교차 오염을 피하기 위해, 그들은 자신의 액체 질소 용기에 즉시 배치해야합니다. 이 RNA 격리 프로토콜은 확장성입니다.

1. 약 0.5-0.75 m의 길이로 볼트를 잘라 전기톱 점수와 두 개 또는 세 곳에 껍질은 볼트의 세로축을 따라.
2. 껍질 그것이 줄기에서 완전히 분리까지 나무에서 별도의 껍질 부분에 다시 당기면서 정을 작업을 계속하기 시작 때까지 나무 치즐 사용하여 점수 영역의 가장자리를 작동합니다.
3. 보조 목부는 껍질 벗겨지고되었습니다 볼트의 길이 방향 축을 따라 스크레이핑하여 직선 가장자리, 단일 양면 레이저와 수확이다. 조직의 오염을 최소화하기 위해 라텍스 장갑을 착용한다.
4. 껍질 섹션의 안쪽에 위치한 체관부는, 쉽게 필링 매뉴얼에 의해 수확이다.
5. 반응 나무는 존중 땅에 그들의 원래 방향을 표시하는 스프레이 페인트를 표시한 다음 사지의 아래쪽에서 수집됩니다.
6. 팔다리는 1-2미터의 볼트로 잘라 반응 나무의 두 가지 유형의 대략적인 위치에 따라 세로 축을 따라 반....

Discussion

침엽수 종에서 고품질의 RNA를 구하기 우디 조직에서 발견 페놀 수지 carbon와 다당류 화합물의 높은 수준을 주어 어려운 작업이 될 수 있습니다. 장 외 개발한 프로토콜로 시작. (1), 우리는 더 엄격한 추출을 발견하고 침엽수 종의 다양한에서 샘플 다양한 우디 및 비 - 우디 조직에서 매우 높은 품질의 총 RNA의 일관된 고립으로 이어질 단계를 정리했습니다. 이 비디오는 우리 수정된 RNA 격리 프로토콜뿐만 아니라 필드 수집 및 절연 RNA하기 전에 로블롤리 파인에 사용되는 처리 기술에서 촬영된 단계뿐만 아니라 증명했다. 이러한 수확 및 준비 단계는 현장에서 수집된 샘플 RNA의 저하를 최소화하기 위해,뿐만 아니라 RNA의 품질과 총 생산량 모두 증가 똑같이 중요합니다. 가장 중요한, 우리는 RNA가 PtGen2 로블롤리 소나무 microarray (2)에 대한 하이브 리다이 제이션에 대한 microarray 목표를 준비하는 데 사용되는 다른 방법에 비해 cDNA 합성 수율을 증가하게되었다이 방법을 사용하여 준비 것으로 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA 분리 완충액			2% CTAB(헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드), 2% PVP(폴리비닐 피롤리디논; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl(pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L 스페르미딘
클로로포름	Fisher Scientific	C298-4
페놀, 초순수	Invitrogen	15509-037
10M LiCl			DEPC 처리수로 제작
SSTE 완충액			1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA(pH8.0)아
세트산나트륨(NaOAc) 3M pH4.8			DEPC 처리된 물
페놀-클로로포름(pH8.0)			으로 제작 120mL 페놀, 160mL 클로로포름 0.5M Tris-Cl pH 8.0
Oak Ridge 고속 테프론 튜브	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#05-562-16B
폴리프로필렌 50mL 고속 튜브	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#05-562-10K
BD Falcon, sterile, capped 50mL conical disposable tubes	VWR international	#21008-939
Phase Lock Gel Heavy, 2mL	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#2302830
Ambion RNase-free 마이크로퓨지 튜브, 2mL	Ambion	#AM12425