배아 척수에서 뉴런의 Commissural 해부와 문화
Summary
이 동영상은 E13 쥐 등의 척수에서 뉴런을 해부하다 commissural과 문화에 대한 방법을 보여줍니다. Dissociated commissural 뉴런이 축삭의 성장과지도의 세포 및 분자 메커니즘을 연구하는 데 유용합니다.
Abstract
Commissural 뉴런 널리 배아 척수 개발 중에 축삭의 가이드를 기본 메커니즘을 조사하는 데 사용되었습니다. 이러한 뉴런의 세포 기관은 등의 척수에 위치하고 axons은 배아 발달 동안 틀에 박힌 궤도를 따라하고 있습니다. Commissural axons 처음 floorplate 향해 ventrally 프로젝트. 정중선을 건너 후 다음 axons은 두뇌 향해 anteriorly 및 프로젝트 설정합니다. 이러한 각 단계는 여러지도 단서의 조치에 의해 규제됩니다. 높은 commissural 뉴런의 풍부한 문화가 이상적으로 돌리는 assays, immunochemistry 및 생화학을 포함하여 축삭의 pathfinding의 메커니즘을 주소 다양한 실험에 적합합니다. 여기, 우리는 E13 쥐 등의 척수에서 뉴런을 해부하다 commissural과 문화에 대한 방법을 설명합니다. 첫째, 척수는 격리되고 지느러미 스트립이 밖으로 해부하고 있습니다. 등의 조직 trypsinization 및 기계적 방해하여 세포 현탁액에 다음 dissociated 있습니다. 뉴런은 폴리 – L – 라이신 – 코팅 유리 coverslips 또는 조직 문화 요리에 도금입니다. 30시간 후<em> 체외에서</em> 대부분의 뉴런은 축삭을 확대했습니다. 문화의 순도 (얨<em> 외.</em> 2009), 일반적으로 90% 이상 commissural 신경 세포의 마커의 DCC, LH2 및 TAG1 (헬름스 앤드 존슨, 1998)과 immunolabeling에 의해 평가하실 수 있습니다. 이것의 연결 준비에 유용한 도구입니다<em> 체외에서</em> 척수 개발 중에 commissural 축삭의 성장과지도의 세포 및 분자 메커니즘 연구.
Protocol
Discussion
우리는 배아 쥐의 척수에서 뉴런을 해부하다 commissural과 문화에 대한 방법을 설명합니다. 이 절차는 정기적으로 안정적으로 축삭지도의 세포 및 분자 메커니즘을 연구하는 뉴런을 준비하기 위해 우리가 실험실에서 사용되고 있습니다. 세포 생물학 및 immunochemistry 실험 한 쓰레기의 해부에 충분한 신경을 생산하고 있습니다. 더 많은 세포가 필요로하는 경우 등 많은 생화학 실험, 두 새끼의 절개처…
Acknowledgements
이 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소 (CIHR), 피터 로히드 의학 연구 재단, Neuroengineering에있는 맥길 프로그램에서 교부금에 의해 지원되었다, 퐁 드 물리 엉 쌍떼 두 퀘벡 (FRSQ), 그리고 혁신에 대한 캐나다 재단 (CFI ). 쎄바스띠앙 D. 랑그르와는 퐁에서 석사 훈련 수상에 의해 지원되었다 드 라 공들인 엉 쌍떼 두 퀘벡 (FRSQ)과 프레드릭 밴팅와 찰스 건강 연구 (CIHR)의 캐나다 연구소에서 최고의 캐나다 대학원 장학금 석사 수상. 우리는 숫자와 함께 도움 제시카 MT 팸에 감사하고 있습니다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Neurobasal medium, liquid | Invitrogen | 21103-049 | See Recipes and Comments | |
| B27 supplement 50X | Invitrogen | 17504 | See Recipes and Comments | |
| Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma | P4707 | ||
| L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-070 | ||
| Trypsin 2.5% (10X) | Invitrogen | 15090-046 | ||
| DNAse I, 25000 U/mL | Worthington | |||
| MgSO4 | Sigma | M2643 | ||
| HBSS, Ca2+/Mg2+-free | Invitrogen | 14170-112 | ||
| L-glutamine 200mM, liquid | Invitrogen | 25030-081 | See Recipes and Comments |
Dissection of embryonic rat dorsal spinal cord (see also Table I)
- E13 pregnancy-staged rat
- Ethanol 70%
- Surgical scissors, Fine Science Tools
- Forceps, Dumont #5, Fine Science Tools
- Petri dishes
- L-15 medium
- Dissection microscope, Leica
- Plastic transfer pipettes
- Microscissors, Fine Science Tools
- Tungsten needles and pin holders (one hook-shaped needle, one L-shapes needle, one straight needle), Fine Science Tools
- Heat-inactivated Horse Serum (HiHS)
- 15 ml plastic tubes
Commissural neuron culture (see also Table I)
- Tissue culture incubators (37°C, 5% CO2, humidity controlled)
- German Desag glass coverslips and/or plastic tissue culture dishes
- Poly-L-lysine, Sigma
- Sterile milliQ H2O
- Neurobasal, Invitrogen
- Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (HiFBS)
- L-Glutamine
- B27, Invitrogen
- Penicillin/Streptomycin antibiotics
- 37°C waterbath
- Sterile Pasteur Pipettes
- Bunsen gas burner
- HBSS, Ca2+/Mg2+-free, Invitrogen
- DNAse, Worthington
- MgSO4
- Centrifuge
- Hemacytometer
- Trypan Blue Solution
References
- Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. , 113-1111 (2003).
- Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F. Segregation of ipsilateral retinal ganglion cell axons at the optic chiasm requires the Shh Receptor Boc. Journal of Neuroscience. 30, 266-275 (2010).
- Helms, A. W., Johnson, J. E. Progenitors of dorsal commissural interneurons are defined by MATH1 expression. Development. 125, 919-928 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).
- Okada, A., Charron, F., Morin, S., Shin, D. S., Wong, K., Fabre, P. J., Tessier-Lavigne, M., McConnell, S. K. Boc is a receptor for sonic hedgehog in the guidance of commissural axons. Nature. 444, 369-373 (2006).
- Yam, P. T., Langlois, S. D., Morin, S., Charron, F. Sonic hedgehog guides axons through a noncanonical, Src-family-kinase-dependent signaling pathway. Neuron. 62, 349-362 (2009).
