Dissezione e la cultura di neuroni embrionali commissurali da midollo spinale
Summary
Questo video illustra un metodo per analizzare e cultura neuroni commissurali dalla E13 del midollo spinale dorsale di ratto. Dissociato neuroni commissurali sono utili per studiare i meccanismi cellulari e molecolari della crescita degli assoni e di orientamento.
Abstract
Commissurali neuroni sono stati ampiamente utilizzati per studiare i meccanismi alla base di guida degli assoni durante lo sviluppo embrionale del midollo spinale. I corpi cellulari di questi neuroni si trovano nel midollo spinale dorsale e la loro assoni seguire traiettorie stereotipati durante lo sviluppo embrionale. Assoni commissurali inizialmente progetto ventralmente verso il fondello. Dopo aver attraversato la linea mediana, questi assoni svolta anteriormente e verso il progetto del cervello. Ognuno di questi passi è regolata dall'azione di spunti di guida diversi. Culture altamente arricchito nei neuroni commissurali sono ideali per molti esperimenti affrontare i meccanismi di pathfinding assone, tra cui saggi di tornitura, immunochimica e biochimica. Qui, descriviamo un metodo per analizzare e cultura neuroni commissurali dalla E13 del midollo spinale dorsale di ratto. In primo luogo, il midollo spinale è isolato e strisce dorsali sono sezionati fuori. Il tessuto dorsale è poi dissociata in una sospensione cellulare da tripsinizzazione e distruzione meccanica. I neuroni sono placcati su poli-L-lisina rivestite coprioggetto di vetro o dei tessuti-cultura piatti. Dopo 30 ore<em> In vitro</em>, La maggior parte dei neuroni hanno esteso un assone. La purezza della cultura (Yam<em> Et al.</em> 2009), di solito oltre il 90%, può essere valutata immunomarcatura con la DCC commissurali marcatori neurone, LH2 e TAG1 (Helms e Johnson, 1998). Questa preparazione neuronale è un utile strumento per<em> In vitro</em> Gli studi dei meccanismi cellulari e molecolari della crescita degli assoni commissurali e la guida durante lo sviluppo del midollo spinale.
Protocol
Discussion
Abbiamo descritto un metodo per analizzare e cultura neuroni commissurali dal midollo spinale di ratto embrionale. Questa procedura è stata utilizzata di routine nel nostro laboratorio per la preparazione affidabile neuroni per studiare i meccanismi cellulari e molecolari di orientamento degli assoni. Per la biologia cellulare e gli esperimenti immunochimica, dissezione di una cucciolata produce i neuroni sufficienti. Quando le cellule sono più necessari, come in molti esperimenti di biochimica, la dissezione di due c…
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR), il Peter Lougheed Medical Research Foundation, il programma di McGill in Neuroingegneria, Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ), e la Fondazione canadese per l'innovazione (CFI ). D. Sébastien Langlois è stato sostenuto dal Premio La formazione di un Master presso il Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ) e da un Frederick Banting e Charles Premio per la Migliore Canada Laurea Borse di Studio del Maestro dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Siamo grati a Jessica MT Pham per l'assistenza con figure.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Neurobasal medium, liquid | Invitrogen | 21103-049 | See Recipes and Comments | |
| B27 supplement 50X | Invitrogen | 17504 | See Recipes and Comments | |
| Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma | P4707 | ||
| L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-070 | ||
| Trypsin 2.5% (10X) | Invitrogen | 15090-046 | ||
| DNAse I, 25000 U/mL | Worthington | |||
| MgSO4 | Sigma | M2643 | ||
| HBSS, Ca2+/Mg2+-free | Invitrogen | 14170-112 | ||
| L-glutamine 200mM, liquid | Invitrogen | 25030-081 | See Recipes and Comments |
Dissection of embryonic rat dorsal spinal cord (see also Table I)
- E13 pregnancy-staged rat
- Ethanol 70%
- Surgical scissors, Fine Science Tools
- Forceps, Dumont #5, Fine Science Tools
- Petri dishes
- L-15 medium
- Dissection microscope, Leica
- Plastic transfer pipettes
- Microscissors, Fine Science Tools
- Tungsten needles and pin holders (one hook-shaped needle, one L-shapes needle, one straight needle), Fine Science Tools
- Heat-inactivated Horse Serum (HiHS)
- 15 ml plastic tubes
Commissural neuron culture (see also Table I)
- Tissue culture incubators (37°C, 5% CO2, humidity controlled)
- German Desag glass coverslips and/or plastic tissue culture dishes
- Poly-L-lysine, Sigma
- Sterile milliQ H2O
- Neurobasal, Invitrogen
- Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (HiFBS)
- L-Glutamine
- B27, Invitrogen
- Penicillin/Streptomycin antibiotics
- 37°C waterbath
- Sterile Pasteur Pipettes
- Bunsen gas burner
- HBSS, Ca2+/Mg2+-free, Invitrogen
- DNAse, Worthington
- MgSO4
- Centrifuge
- Hemacytometer
- Trypan Blue Solution
References
- Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. , 113-1111 (2003).
- Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F. Segregation of ipsilateral retinal ganglion cell axons at the optic chiasm requires the Shh Receptor Boc. Journal of Neuroscience. 30, 266-275 (2010).
- Helms, A. W., Johnson, J. E. Progenitors of dorsal commissural interneurons are defined by MATH1 expression. Development. 125, 919-928 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).
- Okada, A., Charron, F., Morin, S., Shin, D. S., Wong, K., Fabre, P. J., Tessier-Lavigne, M., McConnell, S. K. Boc is a receptor for sonic hedgehog in the guidance of commissural axons. Nature. 444, 369-373 (2006).
- Yam, P. T., Langlois, S. D., Morin, S., Charron, F. Sonic hedgehog guides axons through a noncanonical, Src-family-kinase-dependent signaling pathway. Neuron. 62, 349-362 (2009).
