Разбор и культуры спаечный Нейроны из эмбриональных спинного мозга
Summary
Это видео демонстрирует метод препарировать и культуры спаечный нейроны от E13 крысы спинной спинного мозга. Расхождение между спаечный нейроны полезно изучать клеточные и молекулярные механизмы роста аксонов и руководство.
Abstract
Спаечный нейроны были широко использованы для исследования механизмов, лежащих аксон руководством во время эмбрионального развития спинного мозга. Клеточных тел этих нейронов расположены в спинном спинного мозга и их аксоны следуют стереотипные траектории во время эмбрионального развития. Спаечный аксонов первоначально проект вентрально по отношению к floorplate. После пересечения средней линии, эти аксоны свою очередь, спереди и проекта по отношению к мозгу. Каждый из этих шагов регулируется действием нескольких сигналов руководства. Культуры высоко обогащенного спаечный нейронов идеально подходят для многих экспериментов решении механизмы поиска пути аксонов, включая превращение анализов, иммунохимии и биохимии. Здесь мы опишем метод препарировать и культуры спаечный нейроны от E13 крысы спинной спинного мозга. Во-первых, спинного мозга выделяют и спинной полосы из расчлененных. Спинные ткани затем распадается на клеточной суспензии по трипсинизации и механические разрушения. Нейроны высевали на поли-L-лизин-покровные стекла с покрытием или ткани-культуры блюд. После 30 часов<em> В пробирке</em>, Большинство нейронов расширили аксона. Чистоту культуры (Ям<em> Соавт.</em> 2009), как правило, более 90%, могут быть оценены с immunolabeling спаечный нейрона маркеры DCC, LH2 и ПО1 (Хелмс и Джонсон, 1998). Это нейронов препарат полезным инструментом для<em> В пробирке</em> Изучение клеточных и молекулярных механизмов комиссуральных роста аксонов и руководства во время спинальной развития мозга.
Protocol
Discussion
Мы описали метод препарировать и культуры спаечный нейронов из эмбриональных крыс спинного мозга. Эта процедура была широко используется в нашей лаборатории, чтобы надежно подготовить нейронов изучать клеточные и молекулярные механизмы аксон руководства. Для клеточной биологии и им…
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR), Питер Лоуид Медицинский исследовательский фонд, Программа Макгилла в Neuroengineering, Fonds по исследованиям ан Santé Квебека (FRSQ) и Канаде фонд инноваций (CFI ). Себастьен Д. Ланглуа был поддержан Обучение премии магистра Fonds де-ла-любителя ан santé Квебека (FRSQ) и Фредерик Бантинг и Чарльз премию Лучший Канаде Высшее стипендии магистра канадских институтов здравоохранения (CIHR). Мы благодарны Джессика MT Фам за помощью цифр.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Neurobasal medium, liquid | Invitrogen | 21103-049 | See Recipes and Comments | |
| B27 supplement 50X | Invitrogen | 17504 | See Recipes and Comments | |
| Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma | P4707 | ||
| L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-070 | ||
| Trypsin 2.5% (10X) | Invitrogen | 15090-046 | ||
| DNAse I, 25000 U/mL | Worthington | |||
| MgSO4 | Sigma | M2643 | ||
| HBSS, Ca2+/Mg2+-free | Invitrogen | 14170-112 | ||
| L-glutamine 200mM, liquid | Invitrogen | 25030-081 | See Recipes and Comments |
Dissection of embryonic rat dorsal spinal cord (see also Table I)
- E13 pregnancy-staged rat
- Ethanol 70%
- Surgical scissors, Fine Science Tools
- Forceps, Dumont #5, Fine Science Tools
- Petri dishes
- L-15 medium
- Dissection microscope, Leica
- Plastic transfer pipettes
- Microscissors, Fine Science Tools
- Tungsten needles and pin holders (one hook-shaped needle, one L-shapes needle, one straight needle), Fine Science Tools
- Heat-inactivated Horse Serum (HiHS)
- 15 ml plastic tubes
Commissural neuron culture (see also Table I)
- Tissue culture incubators (37°C, 5% CO2, humidity controlled)
- German Desag glass coverslips and/or plastic tissue culture dishes
- Poly-L-lysine, Sigma
- Sterile milliQ H2O
- Neurobasal, Invitrogen
- Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (HiFBS)
- L-Glutamine
- B27, Invitrogen
- Penicillin/Streptomycin antibiotics
- 37°C waterbath
- Sterile Pasteur Pipettes
- Bunsen gas burner
- HBSS, Ca2+/Mg2+-free, Invitrogen
- DNAse, Worthington
- MgSO4
- Centrifuge
- Hemacytometer
- Trypan Blue Solution
References
- Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. , 113-1111 (2003).
- Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F. Segregation of ipsilateral retinal ganglion cell axons at the optic chiasm requires the Shh Receptor Boc. Journal of Neuroscience. 30, 266-275 (2010).
- Helms, A. W., Johnson, J. E. Progenitors of dorsal commissural interneurons are defined by MATH1 expression. Development. 125, 919-928 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).
- Okada, A., Charron, F., Morin, S., Shin, D. S., Wong, K., Fabre, P. J., Tessier-Lavigne, M., McConnell, S. K. Boc is a receptor for sonic hedgehog in the guidance of commissural axons. Nature. 444, 369-373 (2006).
- Yam, P. T., Langlois, S. D., Morin, S., Charron, F. Sonic hedgehog guides axons through a noncanonical, Src-family-kinase-dependent signaling pathway. Neuron. 62, 349-362 (2009).
