Het testen van het vermogen van diffundeerbare signaalmoleculen om Embryonale Spinal Commissural Axonen Heroriënteer
Summary
Deze test evalueert het vermogen van een signaalmolecuul, hier botmorfogenetisch proteïne 7 (BMP7), om commissural axonen te heroriënteren. Een explant van embryonale dorsale ruggenmerg is gekweekt grenst aan een totaal van COS-cellen afscheiden van de kandidaat groeifactoren. Geheroriënteerd commissural axonen groeien binnen de explantatie worden gevisualiseerd door immunohistochemie.
Abstract
Dorsale commissural axonen in de gewervelde ruggenmerg 1 zijn een onschatbare waarde model systeem in te axon begeleiding signalen te identificeren. We beschrijven hier een in vitro test, "de heroriëntatie assay", dat is uitgebreid gebruikt om het effect van extrinsieke en intrinsieke signalen studie over de oriëntatie van commissural axonen 2. Deze test werd ontwikkeld door een groot aantal mensen in de laboratoria van Jane Dodd, Thomas Jessell en Andrew Lumsden (zie erkenningen voor meer details) en de versies van deze test werden gebruikt om de heroriëntatie van de belangrijkste activiteiten axon begeleiding moleculen aan te tonen, waaronder de BMP chemorepellent in de dakplaat 3,4 en de chemoattractive activiteiten van Netrin1 5 en Sonic Hedgehog (Shh) 6 in de vloerplaat in het ruggenmerg.
Explantaten bestaande uit 2-3 segmenten van de dorsale tweederde van het ruggenmerg zijn ontleed uit embryonale dag (E) 11 ratten en gekweekt in driedimensionale collageen gels 7. E11 dorsale wervelkolom explantaten bevatten pasgeboren commissural neuronen, die kunnen worden geïdentificeerd door hun axonale expressie van het glycoproteïne, Tag1 8. In de loop van 30-40 uur in de cultuur, is de commissural axon traject samengevat in deze dorsale explantaten met een tijdsverloop vergelijkbaar met dat in vivo. Dit axonale traject kan worden aangevochten door het plaatsen van een te testen weefsels of een COS-cel aggregaat uiten van een kandidaat signaalmolecuul in contact met een van de zijkanten van de dorsale explantaat. Commissural axonen te breiden in de omgeving van de bijgevoegde weefsel zal groeien onder invloed van zowel de endogene dakplaat en de signalen van de ectopische laterale weefsel. De mate waarin commissural axonen worden geheroriënteerd onder deze omstandigheden kunnen worden gekwantificeerd. Met behulp van deze test, is het mogelijk zowel te onderzoeken of het toereikendheid van een bepaald signaal om te heroriënteren commissural axonen 3,4 en de noodzaak voor dit signaal aan de commissural traject 9 direct.
Protocol
Discussion
De kritische factoren die het succes bij het uitvoeren van deze test bepalen eerst worden, het weefsel niet moeten worden behandeld met dispase voor te lange periode, zal leiden tot een dergelijke behandeling in het weefsel steeds erg plakkerig en met verminderde levensvatbaarheid. Twee, moet het collageen perfect geprepareerd en bewaard op ijs zo veel mogelijk. Het zal steeds moeilijker te hanteren als het begint ingesteld, dat wil zeggen roze. Drie, moet de wolfraam naald altijd worden bewaard zeer scherp.
Acknowledgements
Dit protocol werd ontwikkeld in de laboratoria van Jane Dodd, Thomas Jessell en Andrew Lumsden. Veel mensen, waaronder Konrad Basler, Ann Calof, Thomas Edlund, Phil Hamilton, Domna Karagogeos, Ariel Ruiz i Altaba en Toshiya Yamada bepaald hoe de cultuur explantaten van het ruggenmerg in collageen. Marysia Placzek en Marc Tessier-Lavigne een pionier in de techniek van het gebruik van axon groei van in vitro explantaten als een middel ter identificatie van axon begeleiding moleculen. Werk in het laboratorium Butler wordt ondersteund door subsidies van de March of Dimes en R01 NS063999 van NIH / NINDS.
References
- Altman, J., Bayer, S. A. . The development of the rat spinal cord. , (1984).
- Placzek, M. Tissue recombinations in collagen gels. Methods in molecular biology. , 325-335 (2008).
- Augsburger, A., Schuchardt, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24, 127-141 (1999).
- Butler, S. J., Dodd, J. A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons. Neuron. 38, 389-401 (2003).
- Kennedy, T. E., Serafini, T. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78, 425-435 (1994).
- Charron, F., Stein, E. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. 113, 11-23 (2003).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Dodd, J., Morton, S. B. Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons. Neuron. 1, 105-116 (1988).
- Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions. Development. 135, 1119-1128 (2008).
