Assaying את היכולת של מולקולות איתות Diffusible כדי כיוון מחדש עובריים האקסונים Commissural השדרה
Summary
Assay זה מעריך את היכולת של מולקולות איתות, עצם פה חלבון המוךפו"גנטי שהולך 7 (BMP7), לארגון מחדש של אקסונים commissural. Explant של חוט השדרה הגבי העובריים בתרבית הסמוכים המצרפי של הפרשת התאים COS הצמיחה גורמים מועמד. אקסונים commissural ההתמצאות גדל בתוך explant הם דמיינו ידי אימונוהיסטוכימיה.
Abstract
אקסונים commissural הגבי בעמוד השדרה חוליות 1 כבר מערכת מודל יסולא בפז שבו כדי לזהות אותות הדרכה האקסון. כאן אנו מתארים ב assay חוץ גופית, "assay ארגון מחדש", כי כבר נעשה שימוש נרחב כדי לחקור את ההשפעה של אותות החיצונית והרמה הפנימית על האוריינטציה של אקסונים commissural 2. Assay זו פותחה על ידי אנשים רבים במעבדות של ג'יין דוד, תומאס Jessell ואנדרו לומסדן (ראה התודות לפרטים נוספים) וגירסאות של assay זה שימשו כדי להדגים את פעולות ארגון מחדש של מולקולות הנחיה מפתח האקסון, כולל BMP chemorepellent ב הגג צלחת 3,4 ופעילות chemoattractive של Netrin1 5 ו סוניק הקיפוד (ששש) 6 בצלחת הרצפה בחוט השדרה.
Explants הכולל 2-3 שכבות הגבי שני שלישים של עמוד השדרה הם גזור מיום עובריים (E) 11 חולדות תרבותי בשלוש ג'ל קולגן ממדי 7. Explants E11 השדרה הגבי מכילים נוירונים commissural שזה עתה נולד, אשר ניתן לזהות על ידי ביטוי axonal שלהם גליקופרוטאין, Tag1 8. במהלך 30-40 שעות בתרבות, מסלול האקסון commissural הוא סיכם אלה explants הגב עם כמובן זמן דומה לזה ראיתי in vivo. מסלול זה axonal ניתן לערער על ידי הצבת או רקמות מבחן או במצטבר תא COS להביע מולקולה מועמד איתות במגע עם אחד הקצוות לרוחב של explant הגבי. אקסונים Commissural הארכת באזור של רקמת צירף יגדל תחת השפעת הצלחת שני גג אנדוגני אותות מן הרקמה לרוחב חוץ רחמי. המידה שבה הם אקסונים commissural ההתמצאות בנסיבות אלו ניתן לכמת. שימוש assay זה, אפשר גם לבחון את ההסתפקות של אות מסוים לארגון מחדש של אקסונים commissural 3,4 כמו גם הצורך לאות זה לכוון את מסלול commissural 9.
Protocol
Discussion
גורמים קריטיים הקובעים הצלחה בביצוע הזה assay הם הראשון, רקמות לא צריכים להיות מטופלים עם dispase לתקופה ממושכת מדי, טיפול כזה יביא הרקמה להיות דביק מאוד לאחר ירידה הכדאיות. שני, קולגן חייב להיות דרוך לחלוטין ושמר על הקרח כמה שיותר. זה יהיה קשה יותר ויותר להתמודד אם זה מתחיל…
Acknowledgements
פרוטוקול זה פותח במעבדות של ג'יין דוד, תומאס Jessell ואנדרו לומסדן. אנשים רבים, כולל קונרד Basler, אן Calof, תומאס Edlund, פיל המילטון, Domna Karagogeos, אריאל רואיז אני Altaba ו Toshiya יאמאדה נקבע כיצד explants תרבות של חוט השדרה של קולגן. מרישה Placzek ומארק טסייה-לאבין חלוץ בטכניקה של צמיחה באמצעות האקסון מ ב explants במבחנה כאמצעי זיהוי מולקולות הנחיה האקסון. עבודה במעבדה באטלר נתמך על ידי תרומות של מצעד הפרוטות ו R01 NS063999 מ-NIH / NINDS.
References
- Altman, J., Bayer, S. A. . The development of the rat spinal cord. , (1984).
- Placzek, M. Tissue recombinations in collagen gels. Methods in molecular biology. , 325-335 (2008).
- Augsburger, A., Schuchardt, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24, 127-141 (1999).
- Butler, S. J., Dodd, J. A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons. Neuron. 38, 389-401 (2003).
- Kennedy, T. E., Serafini, T. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78, 425-435 (1994).
- Charron, F., Stein, E. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. 113, 11-23 (2003).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Dodd, J., Morton, S. B. Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons. Neuron. 1, 105-116 (1988).
- Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions. Development. 135, 1119-1128 (2008).
