Testmetoder förmåga diffusionsväte signalmolekyler för att inrikta Embryonala Spinal commissural Axoner

Summary

Denna analys bedömer förmågan hos en signalmolekyl, här Benmorfogenetiska Protein 7 (BMP7), för att inrikta commissural axoner. En Explantation av embryonala dorsal ryggmärgen är odlade i anslutning till ett sammanlagt COS celler utsöndrar kandidaten tillväxtfaktorer. Omorienterat commissural axoner växer inom Explantation synliga genom immunohistokemi.

Abstract

Dorsal commissural axoner i ryggradsdjur ryggmärgen ¹ har en ovärderlig modellsystem där för att identifiera signaler Axon vägledning. Här beskriver vi en in vitro ", den nya inriktningen assay", som har används i stor utsträckning för att studera effekten av yttre och inneboende signaler om inriktningen på commissural axoner ^2. Denna analys har utvecklats av många personer i laboratorier Jane Dodd, Thomas Jessell och Andrew Lumsden (se erkännanden för mer information) och versioner av denna analys användes för att demonstrera omorientering verksamhet viktiga molekyler Axon vägledning, inklusive BMP chemorepellent i takplåt ^3,4 och chemoattractive verksamhet Netrin1 ⁵ och Sonic Hedgehog (Shh) ⁶ i golvet plattan i ryggmärgen.

Explants bestående av 2-3 segment på rygg två tredjedelar av ryggmärgen dissekeras från embryonala dag (E) 11 råttor och odlas i tredimensionell kollagen geler ^7. E11 rygg spinal explants innehåller nyfödda commissural nervceller, som kan identifieras genom sina axonal uttryck för glykoprotein, Tag1 ^8. Under loppet av 30-40 timmar i kulturen, är commissural axonet banan rekapitulerade i dessa dorsal explants med en tid kursen liknar den som ses in vivo. Detta axonal bana kan utmanas genom att antingen testa vävnader eller en COS cell samlade uttrycker en kandidat signalmolekyl i kontakt med en av sidokanter rygg Explantation. Commissural axoner sträcker sig i närheten av den bifogade vävnad kommer att växa under inflytande av både de endogena takplåt och signaler från ektopisk laterala vävnad. I vilken grad commissural axoner är en ny inriktning under dessa omständigheter kan kvantifieras. Med hjälp av denna analys är det möjligt att både undersöka tillräckliga för en viss signal till omorientera commissural axoner ^3,4 samt nödvändigheten av denna signal för att styra commissural bana ^9.

Protocol

Del 1: Förberedelse av aggregat av transfekterade COS celler med hängande Drops Seed COS-7 (COS) celler i 35mm kultur rätter. När de når 80% confluency, transfektera 1μg av uttrycket plasmiden in i cellerna med hjälp av Lipofectamine2000 enligt tillverkarens s protokoll. För att förbereda hängande droppar, aspirera transfektion mediet och skölj transfekterade COS celler med 1 ml 1x Fosfatbuffrad Solution (PBS). Behandla celler med 0,5 ml enzym-fri ruta dissociation medium för 15 minuter….

Discussion

De kritiska faktorer som avgör framgång i att utföra denna analys är det första bör vävnaden inte behandlas med dispase under alltför lång en period, kommer en sådan behandling resultera i vävnaden blir mycket trög och har minskat lönsamheten. Två måste kollagen vara helt förberedd och förvaras på is så mycket som möjligt. Det blir allt svårare att hantera om det börjar att ställa in, dvs bli rosa. Tre måste volfram nål alltid hållas mycket skarp.

Materials