Dosage de la capacité des molécules de signalisation diffusibles à réorienter embryonnaires épinière axones commissuraux
Summary
Ce test évalue la capacité d'une molécule de signalisation, voici protéine morphogénétique osseuse 7 (BMP-7), à réorienter les axones commissuraux. Un explant de la moelle épinière embryonnaire dorsal est cultivée adjacente à un agrégat de cellules COS sécrétant des facteurs de croissance candidat. Réorienté axones commissuraux croissante au sein de l'explant sont visualisées par immunohistochimie.
Abstract
Dorsale axones commissuraux de la moelle épinière des vertébrés 1 ont été une précieuse système modèle dans lequel d'identifier des signaux de guidage axonal. Ici, nous décrivons un test in vitro, «le test de réorientation», qui a été largement utilisée pour étudier l'effet des signaux extrinsèques et intrinsèques de l'orientation des axones commissuraux 2. Ce test a été développé par de nombreuses personnes dans les laboratoires de Jane Dodd, Thomas et Andrew Lumsden Jessell (voir les remerciements pour plus de détails) et les versions de cet essai ont été utilisés pour démontrer les activités réorientation des principales molécules de guidage axonal, y compris le chemorepellent dans le BMP 3,4 toit en tôle et les activités des chimioattractives Netrin1 5 et Sonic Hedgehog (Shh) 6 dans la plaque de sol dans la moelle épinière.
Explants comprenant 2-3 segments de la dorsale des deux tiers de la moelle épinière sont disséqués par jour embryonnaire (E) 11 rats et de culture en trois dimensions des gels de collagène 7. E11 dorsale explants épinière contiennent les neurones nouvellement né commissurale, qui peuvent être identifiés par leur expression axonale de la glycoprotéine, Tag1 8. Au cours de 30-40 heures de culture, de la trajectoire des axones commissuraux est résumée dans ces explants dorsal avec un cours à temps similaire à celle observée in vivo. Cette trajectoire axonale peut être contestée en plaçant les tissus essai ou un agrégat de cellules COS exprimant une molécule candidate de signalisation en contact avec l'un des bords latéraux de l'explant dorsale. Axones commissuraux s'étendant au voisinage du tissu annexé feront croître sous l'influence de l'ensemble de la plaque de toit endogènes et les signaux provenant du tissu ectopique latéral. Le degré auquel les axones commissuraux sont réorientés dans ces circonstances peuvent être quantifiés. L'utilisation de ce test, il est possible à la fois d'examiner la suffisance d'un signal particulier de réorienter les axones commissuraux 3,4 ainsi la nécessité pour ce signal pour diriger la trajectoire commissurale 9.
Protocol
Discussion
Les facteurs critiques qui déterminent le succès dans l'accomplissement de ce test sont tout d'abord, le tissu ne doit pas être traitée avec dispase trop prolongée d'une période, un tel traitement se traduira dans le tissu devient très collant et ayant diminué la viabilité. Deux, le collagène doit être parfaitement apprêté et conservés sur la glace autant que possible. Il deviendra plus difficile à gérer si elle commence à mettre, c'est à dire virer au rose. Trois, l'aiguille de tun…
Acknowledgements
Ce protocole a été développé dans les laboratoires de Jane Dodd, Thomas et Andrew Lumsden Jessell. Beaucoup de gens, y compris Konrad Basler, Ann Calof, Thomas Edlund, Phil Hamilton, Domna Karagogeos, Ariel Ruiz i Altaba et Toshiya Yamada déterminé comment la culture des explants de moelle épinière dans le collagène. Marysia Placzek et Marc Tessier-Lavigne pionnier de la technique d'utilisation de la croissance axonale à partir dans des explants in vitro comme un moyen d'identifier les molécules de guidage axonal. Le travail dans le laboratoire de Butler est soutenu par des subventions de la Mars of Dimes et R01 NS063999 du NIH / NINDS.
References
- Altman, J., Bayer, S. A. . The development of the rat spinal cord. , (1984).
- Placzek, M. Tissue recombinations in collagen gels. Methods in molecular biology. , 325-335 (2008).
- Augsburger, A., Schuchardt, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24, 127-141 (1999).
- Butler, S. J., Dodd, J. A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons. Neuron. 38, 389-401 (2003).
- Kennedy, T. E., Serafini, T. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78, 425-435 (1994).
- Charron, F., Stein, E. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. 113, 11-23 (2003).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Dodd, J., Morton, S. B. Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons. Neuron. 1, 105-116 (1988).
- Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions. Development. 135, 1119-1128 (2008).
