पुनः संयोजक प्रोटीन के Methylotrophic खमीर में अभिव्यक्ति Pichia pastoris</em
Summary
प्रोटोकॉल methylotrophic खमीर का उपयोग प्रोटीन अभिव्यक्ति का वर्णन<em> Pichia pastoris</em>. electrocompetent खमीर कोशिकाओं, वेक्टर के साथ ब्याज की जीन में परिवर्तन की तैयारी<em> पी. pastoris</em> और खमीर डीएनए शुद्धि भी प्रदर्शन कर रहे हैं. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण और प्रोटीन शुद्धि इस प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोटोकॉल में अंतिम कदम का निर्माण.
Abstract
माइक्रोबियल यूकेरियोटिक मेजबान Pichia pastoris में प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए एक तेज और आसान उपयोग करने के लिए अभिव्यक्ति प्रणाली में पुनः संयोजक प्रोटीन की उच्च मात्रा में उत्पन्न की संभावना प्रदान करता है.
के रूप में एक एकल celled सूक्ष्मजीव पी. pastoris हेरफेर करने के लिए आसान है और उच्च सेल घनत्व में सस्ती मीडिया पर तेजी से बढ़ता है . एक eukaryote, पी. होने के नाते pastoris बाद translational संशोधनों उच्च यूकेरियोटिक कोशिकाओं और पुनः संयोजक प्रोटीन प्राप्त द्वारा प्रदर्शन के कई प्रोटीन तह, proteolytic प्रसंस्करण, डाइसल्फ़ाइड बांड गठन और [1] ग्लाइकोसिलेशन से गुजरना करने के लिए प्रदर्शन करने में सक्षम है.
के रूप में एक methylotrophic खमीर पी. pastoris अपने एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में मेथनॉल metabolizing के लिए सक्षम है . शराब oxidase, AOX1, के लिए मजबूत प्रमोटर कसकर विनियमित है और मेथनॉल से प्रेरित है और यह हित के जीन की अभिव्यक्ति के लिए प्रयोग किया जाता है. तदनुसार, मध्यम विकास के लिए मेथनॉल जोड़कर विदेशी प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रेरित किया जा सकता है [2, 3].
एक अन्य महत्वपूर्ण लाभ मध्यम विकास में पुनः संयोजक प्रोटीन का स्राव है, एक संकेत अनुक्रम का उपयोग कर पी. pastoris की स्रावी मार्ग विदेशी प्रोटीन लक्ष्य. अंतर्जात खमीर ही मीडिया के लिए secreted प्रोटीन और मीडिया को नहीं जोड़ा प्रोटीन का ही निम्न स्तर के साथ, एक heterologous प्रोटीन मध्यम में कुल प्रोटीन के बहुमत बनाता है और प्रोटीन शुद्धि चरणों का पालन की सुविधा [3, 4].
α कारक पुनः संयोजक प्रोटीन, दोनों ई. में एक Zeocin चयन के लिए प्रतिरोध जीन के स्राव के लिए स्राव संकेत; यहां इस्तेमाल किया वेक्टर (pPICZαA) कसकर विनियमित, मेथनॉल प्रेरित हित के जीन की अभिव्यक्ति के लिए AOX1 प्रमोटर शामिल कोलाई और Pichia और सी टर्मिनल पेप्टाइड युक्त सी Myc मिलान और पता लगाने और एक पुनः संयोजक प्रोटीन की शुद्धि के लिए एक polyhistidine टैग (6xHis) . हम भी विशिष्ट विरोधी myc-एचआरपी माता पिता वेक्टर पर मिलान सी Myc पहचानने एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए पुनः संयोजक प्रोटीन के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण दिखाते हैं.
Protocol
Discussion
प्रोटीन एक मेजबान सिस्टम के रूप में अभिव्यक्ति का उपयोग methylotrophic खमीर Pichia pastoris इस प्रोटोकॉल में वर्णित है. प्रोटीन प्रयुक्त क्लोनिंग सदिश के आधार पर मध्यम में secreted किया जा सकता है है. पुनः संयोजक प्रोटीन क…
Acknowledgements
हम इस कार्य का समर्थन करने के लिए अभिनव, ब्रिटिश कोलंबिया नॉलेज डेवलपमेंट फंड और स्वास्थ्य अनुसंधान (CIHR) के संस्थान कनाडा के लिए कनाडा फाउंडेशन धन्यवाद देना चाहूंगा. मीट्रिक टन तुला नींव वित्त पोषित माइक्रोबियल विविधता और इवोल्यूशन (कमोडोर) के लिए केंद्र से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया.
References
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