在甲醇酵母表达的重组蛋白毕赤酵母</em
Summary
协议描述使用甲醇酵母蛋白的表达<em>毕赤酵母</em>。 electrocompetent酵母细胞的准备，与感兴趣的基因到改造的载体<em> P。酵母</em>和酵母DNA纯化。 Western blot分析和蛋白质纯化，建立在这种蛋白的表达协议的最后步骤。
Abstract
蛋白质在微生物的真核宿主毕赤酵母中的表达提供了可能产生一个快速且易于使用的表达系统的重组蛋白的高含量。
作为一种单细胞微生物体育酵母是容易操纵的，并在高细胞密度的廉价媒体迅速成长。作为真核细胞，P。酵母是能够执行许多更高的真核细胞中获得的重组蛋白进行翻译后修饰进行蛋白质折叠，蛋白加工，形成二硫键和糖基化[1 ]。
由于甲醇酵母P.酵母是甲醇作为唯一的碳源代谢。强启动醇氧化酶AOX1，严格监管和甲醇诱导和它感兴趣的基因的表达。因此，外源蛋白的表达可诱导培养基中[2加入甲醇; 3]。
另一个重要优势是重组蛋白分泌到培养基中，使用一个信号序列为目标的外源蛋白毕赤酵母的分泌途径。媒体酵母本身分泌的内源性蛋白和媒体没有添加蛋白质水平低，外源蛋白建立在介质中的总蛋白的多数，有利于蛋白质纯化步骤[3，4]。
这里所用的载体（pPICZαA）含有AOX1启动子的严格监管，甲醇诱导感兴趣的基因的表达，一个可供选择的Zeocin 抗性都大肠杆菌基因重组蛋白，分泌的α-因子的分泌信号大肠杆菌和毕赤酵母和C -末端肽含c – myc基因的抗原表位和多聚组氨酸（6xHis）检测和纯化重组蛋白的标记。我们也使用特定的抗 myc – HRP抗体承认父向量的C – myc基因的抗原表位的重组蛋白质免疫印迹分析。
Protocol
Discussion
蛋白的表达，使用甲醇毕赤酵母作为主机系统，是在本议定书。蛋白可分泌到根据使用的克隆载体介质。重组蛋白的分泌，使后续的纯化更容易。然而，所显示的条件可能要为不同的蛋白质和条件和表达时间的变化表达优化，可能导致蛋白质水平增加。在本议定书中所使用的向量有一个c – myc基因的抗原表位，并可以购买此抗原表位的抗体的功能。其中有没有抗体，这使得蛋白质的分…
Acknowledgements
我们要感谢支持这项工作的创新，不列颠哥伦比亚省知识发展基金和卫生研究所（CIHR）加拿大研究所，加拿大基金会。 MT是从微生物的多样性和进化（CMDE）图拉基金会资助中心的奖学金支持。
References
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