Expression von rekombinanten Proteinen in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris</em
Summary
Das Protokoll beschreibt die Proteinexpression mit der methylotrophen Hefe<em> Pichia pastoris</em>. Die Aufstellung von elektrokompetente Hefezellen, Transformation der Vektor mit dem Gen von Interesse in<em> P. pastoris</em> Und Hefe DNA-Aufreinigung werden ebenfalls durchgeführt. Western-Blot-Analyse und Reinigung von Proteinen bilden die letzten Schritte in diesem Protein-Expression-Protokoll.
Abstract
Proteinexpression in der mikrobiellen eukaryotischen Wirt Pichia pastoris bietet die Möglichkeit, große Mengen an rekombinantem Protein in einem sich schnell und einfach zu bedienen Expressionssystem zu generieren.
Als einzellige Mikroorganismen P. pastoris ist leicht zu manipulieren und wächst schnell auf kostengünstige Medien bei hohen Zelldichten. Als Eukaryoten, P. pastoris ist in der Lage, erfüllen viele der post-translationale Modifikationen von höheren eukaryotischen Zellen und die erhaltenen rekombinanten Proteinen durchgeführt unterziehen Proteinfaltung, proteolytische Prozessierung, Disulfidbindungsbildung und Glykosylierung [1].
Als methylotrophen Hefe P. pastoris ist in der Lage metabolisierenden Methanol als einzige Kohlenstoffquelle. Die starken Promotor für Alkohol-Oxidase, AOX1, ist streng reguliert und induziert durch Methanol und es ist für die Expression des Gens von Interesse verwendet werden. Dementsprechend kann die Expression des fremden Proteins durch Zugabe von Methanol zum Wachstumsmedium induziert werden [2, 3].
Ein weiterer wichtiger Vorteil ist die Sekretion des rekombinanten Proteins in das Nährmedium mit einer Signalsequenz auf das fremde Eiweiß zu den sekretorischen Weg von P. pastoris Ziel. Mit nur geringen endogenes Protein abgesondert wird, um die Medien von der Hefe selbst und ohne Zusatz von Proteinen an die Medien, baut eine heterologe Protein die Mehrheit des gesamten Proteins in das Medium und ermöglicht folgende Proteinreinigung Schritte [3, 4].
Der Vektor verwendet hier (pPICZαA) enthält die AOX1 Promotor für streng reguliert, Methanol-induzierte Expression des Gens von Interesse, die α-Faktor-Sekretion Signal für die Sekretion des rekombinanten Proteins, ein Zeocin-Resistenzgen für die Selektion in E. coli und Pichia und eine C-terminale Peptid, das die c-myc-Epitop und ein Polyhistidin (6xHis) Tag zur Detektion und Reinigung eines rekombinanten Proteins. Wir zeigen auch, Western-Blot-Analyse des rekombinanten Proteins mit dem spezifischen Anti-myc-HRP Antikörper erkennen die c-myc-Epitop auf dem übergeordneten Vektor.
Protocol
Discussion
Proteinexpression mit der methylotrophen Hefe Pichia pastoris als Host-System wird in diesem Protokoll beschrieben. Das Protein kann in das Medium in Abhängigkeit der verwendeten Klonierungsvektor sezerniert werden. Die Sekretion des rekombinanten Proteins ist die anschließende Reinigung zu erleichtern. Allerdings können die gezeigten Bedingungen müssen für die Expression verschiedener Proteine und Änderungen in den Bedingungen und Ausdruck optimiert werden, kann zu erhöhten Protein-Ebene führen. …
Acknowledgements
Wir möchten den kanadischen Stiftung für Innovation, der British Columbia Knowledge Development Fund und der Canadian Institutes of Health Research (CIHR) für die Unterstützung dieser Arbeit danken. MT wurde durch ein Stipendium von der Stiftung finanziert TULA Zentrum für Mikrobielle Vielfalt und Evolution (CMDE) unterstützt.
References
- Cereghino, G. P., Cregg, J. M. Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis. Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).
- Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. Pichia pastoris as a Host System for Transformations. Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).
- Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. Recombinant protein expression in Pichia pastoris. Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).
- Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris. Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).
