Methylotrophic 효모에서 재조합 단백질의 표현 Pichia pastoris의</em

Summary

프로토콜은 methylotrophic 누룩을 사용하여 단백질 발현을 설명합니다<em> Pichia pastoris의</em>. electrocompetent 효모 세포의 준비, 관심의 유전자에있는 벡터의 변화<em> P. pastoris</em>과 효모 DNA 정화도 수행됩니다. 서양 얼룩 분석 및 단백질 정화는이 단백질 표현 프로토콜의 마지막 단계를 빌드합니다.

Abstract

미생물 진핵 숙주 Pichia pastoris에서 단백질의 표현은 빠르고 사용하기 쉬운 표현 시스템에서 재조합 단백질의 높은 금액을 생성할 수있는 가능성을 제공합니다.

단세포 미생물로서 P. pastoris는 조작하기 쉬운 높은 세포 밀도에서 저렴한 미디어에 빠르게 자랍니다. 진핵세포 생물, P. 웰빙 pastoris 높은 진핵 세포 얻은 재조합 단백질에 의해 수행 사후 translational 수정의 많은 단백질 접힘, proteolytic 처리, 이황화 결합 형성과 글리코 실화 [1]를 받아야 수행할 수 있습니다.

methylotrophic 효모 P.으로 pastoris는 유일한 탄소 소스로 메탄올을 metabolizing이 가능합니다. 알코올 산화 효소, AOX1에 대한 강력한 발기인은 밀접하게 규제와 메탄올에 의해 유도하고 그것은 관심의 유전자의 표현에 사용된다. 따라서, 외국 단백질의 표현은 성장 매체 메탄올을 추가하여 유도된 수있다 [2, 3].

또 다른 중요한 장점은 P. pastoris의의 분비 경로로 외국 단백질을 대상으로 신호 시퀀스를 사용하여 성장 매체로 재조합 단백질의 분비이다. 효모 자체로 미디어에 분비 내생 단백질과 언론 노 추가 단백질만을 낮은 수준, heterologous 단백질은 매체에있는 총 단백질의 대부분을 빌드하고 단백질 정화 단계에 따라 용이하게 [3, 4].

재조합 단백질, E. 모두 선택할 Zeocin 저항 유전자의 분비에 대한 α – 계수 분비 신호, 여기에 사용되는 벡터는 (pPICZαA) 관심있는 유전자의 꽉 규제, 메탄올 유도된 표현 AOX1 발기인을 포함 대장균과 Pichia 및 C – myc 에피토프 및 재조합 단백질의 감지 및 정화를위한 polyhistidine (6xHis) 태그를 포함하는 C – 말단 펩타이드. 우리는 또한 부모 벡터의 C – myc의 에피토프을 인식하는 특정 안티 – myc – HRP 항체를 사용하여 재조합 단백질의 서양 얼룩 분석을 보여줍니다.

Protocol

methylotrophic 효모 Pichia pastoris의 재조합 단백질의 표현 이 프로토콜을 시작하기 전에 당신은 P.의 프레임에 복제된 관심의 유전자가 있어야 그것은 벡터에 대한 관심의 유전자의 정확한 삽입 확인하는 pastoris의 부모 벡터 및 합성있다. 단계 I : P.으로 구조 변화의 선형화을 electrocompetent 효모 세포를 생성 pastoris <p class="jove_…

Discussion

호스트 시스템으로 methylotrophic 효모 Pichia pastoris의를 사용하여 단백질 발현이 프로토콜에 설명되어 있습니다. 단백질이 사용된 복제 벡터에 따라 매체에 분비 수 있습니다. 재조합 단백질의 분비는 이후의 정화가 쉬워집니다. 그러나, 표시 조건이 증가 단백질 수준에서 발생할 수 있습니다 서로 다른 단백질과 조건과 표현 시대의 변화의 표현에 최적해야 할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사?…