Denna metod användes i forskningen redovisas i Lieberman-Aiden et al. 326 Science, 289-293 (2009) . I. crosslinking, matsmältning, Märkning av DNA-ändar, och Blunt slut Ligation Hi-C börjar med crosslinking av celler, som är en röd tråd bland alla 3C-baserade metoder. Till att börja växa mellan 2 x 10 7 och 2,5 x 10 7 däggdjursceller, varken anhängare eller i suspension, och Crosslink cellerna. (För detaljer om broarna av celler, se: 11 Lyse cellerna i 550 l lysisbuffer (500 l 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,2% Igepal CA-630 och 50 l proteashämmare) med hjälp av en homogeniseringsapparat. Snurra kromatin vid 5000 rpm och tvätta pellets två gånger med 500 l 1x NEBuffer 2. Resuspendera kromatin i 1x NEBuffer 2, uppmätt i 5 numrerade rör och tillsätt 1x NEBuffer 2 till en slutlig volym på 362 l. Tillsätt 38 l 1% SDS, blanda försiktigt och inkubera vid 65 ° C i 10 minuter. Placera rören tillbaka på isen direkt efter inkubation. Släck SDS genom att tillsätta 44 l Triton X-100 och blanda noga. Digest kromatinet genom att lägga till 400 enheter av HindIII och inkubera vid 37 ° C över natten vid rotation. Nästa steg är Hi-C specifika och inkluderar märkning DNA slutar med biotin och utför trubbig slut ligation av tvärbunden fragment. Detta steg kommer att tillåta ligering korsningar som skall renas senare. Rör 1 bör inte genomgå biotinylation steg och bör istället hållas åtskilda och fungera som en 3C kontroll för att säkerställa att matsmältningen, och ligation förhållandena var optimala. För att fylla i överhängen begränsning fragment och markera DNA slutar med biotin i de återstående 4 rör, tillsätt 1,5 l 10 mM dATP, 1,5 l 10 mM dGTP, 1,5 l 10 mM dTTP, 37,5 l 0,4 mM biotin-14-dCTP och 10 l 5U/μl Klenow att rören 2-5. Blanda försiktigt och inkubera i 45 minuter vid 37 ° C. Placera rören på is. För att inaktivera enzymer, lägga till 86 l 10% SDS att rören 1-5. Inkubera rören vid 65 ° C i exakt 30 minuter och lägg dem på is direkt efteråt. Den ligatur utförs under extremt späd villkor för att gynna ligation händelser mellan tvärbunden fragment. Arbeta på is, tillsätt 7,61 blanda ml ligation [745 l 10% Triton X-100, 745 l 10x ligation buffert (500 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mm MgCl 2, 100 mm DTT), 80 l 10 mg / ml BSA , 80 l 100 mM ATP och 5,96 ml vatten] för att var och en av fem numrerade 15 ml rör. Överför varje rötas kromatin blandningen till en motsvarande 15 ml rör. För regelbunden 3C ligation, tillsätt 10 l 1U/μl T4 DNA-ligas för att tub 1. För trubbig-end Hi-C ligation, tillsätt 50 l 1U/μl T4 DNA-ligas för att rören 2-5. Blanda genom att vända rören och inkubera alla 5 rör för 4 timmar vid 16 ° C. Antipyridinantikropp ombytta och protein bryts ned genom tillsats av 50 l 10 mg / ml proteinas K per rör och inkubera rören över natten vid 65 ° C. Lägg till ytterligare 50 l 10 mg / ml proteinas K per rör nästa dag och fortsätta inkubation vid 65 ° C i ytterligare 2 timmar. Kyl reaktionsblandningarna till rumstemperatur och överföra dem till fem 50 ml koniska rör. Rena DNA i dessa rör genom att utföra en fenol extraktion. Tillsätt 10 ml fenol pH 8,0 och skaka i 2 minuter. Spin rören i 10 minuter vid 3500 rpm och försiktigt överföra så mycket av vattenfas som möjligt till ett nytt 50 ml rör. Upprepa extraktionen med hjälp av fenol pH 8,0: kloroform (1:1) och fällningen DNA med etanol. (Mer information om DNA-rening, se: 11 Efter centrifugering av etanol utfällda DNA, lös upp varje DNA pelleten i 450 l 1x TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA). Överför DNA-blandningen till ett 1,7 ml centrifugrör. En ny omgång rening sker genom att göra 2 fenol: kloroform extraktioner. Tillsätt 500 l fenol pH 8,0: kloroform (1:1) och skaka i 1 minut. Centrifugera rören i 5 minuter vid 14.000 rpm och överföra vattenfasen till ett nytt rör. Efter den andra utvinning, fällning DNA genom att tillsätta 0,1 x volym NaOAc, 2x volym på 100% etanol och inkubera 30 minuter vid -80 ° C. Efter spinning ner fälls DNA, tvätta varje DNA-pellets med 70% etanol och återsuspendera varje DNA pelleten i 25 l 1x TE. Förnedra någon RNA som kan finnas genom att tillsätta 1 l 1 mg / ml RNAse A per rör och inkubera rören i 30 minuter vid 37 ° C. Pool Hi-C-innehållet i tuber 2-5, fortfarande hålla rör 1 separat som en 3C kontroll. Nu är ett bra tillfälle att undersöka Hi-C-märkning och ligering effektivitet. Dessa kontroller är utmärkta indikatorer på om en Hi-C-bibliotek kommer att bli framgångsrik. Att kontrollera kvaliteten och kvantiteten av bibliotek, kör 2 l och 6 l alikvoter av 1:10 utspädningar från både 3C och Hi-C-bibliotek på en 0,8% agarosgel. (Se Figur 2A) Hi-C-märkning och Hi-C ligation effektivitet kontrolleras av ett PCR smälta analys. Lyckad fylla i och ligation en HindIII plats (AAGCTT) skapar en plats för restriktionsenzymanalys NheI (GCTAGC). En särskild ligatur produkt bildas från två närliggande begränsning fragment förstärks med PCR (som i 3C 11 med 0,2 l av varje bibliotek som mall. PCR-produkterna därefter kokas med HindIII, NheI eller både och. Efter att ha kört prover på en 2% gel kan det relativa antalet 3C och Hi-C händelser ligation beräknas genom att kvantifiera intensiteten i snitt och uncut banden (se figur 2B). Några brottstycken inte har knyts ihop: att undvika att dra ner dem senare, ta bort biotin från dessa unligated slutar med exonuclease aktivitet T4 DNA-polymeras. Biotin-14-dCTP till icke-knyts ihop DNA slutar tas bort med exonuclease aktivitet T4 DNA-polymeras. Blanda 5 mikrogram av Hi-C-bibliotek med 1 l 10 mg / ml BSA, 10 l 10x NEBuffer 2, 1 l 10 mM dATP, 1 l 10 mM dGTP och 5 enheter T4 DNA-polymeras i en total volym på 100 l och inkubera blandningen vid 12 ° C i 2 timmar. Om möjligt är flera 5 mikrogram reaktioner utförs. Reaktionen stoppas genom att tillsätta 2 l 0,5 M EDTA pH 8,0. Att rena DNA, en fenol pH 8,0: kloroform (1:1) utvinning sker följt av etanol nederbörd. Supernatanten tas bort och DNA pellets är suspenderade och samlas i en total volym av 100 l vatten. II. Klippning och storlek Urval För att göra biotinylerad DNA som lämpar sig för hög genomströmning sekvensering, måste DNA klippt till en storlek på 300-500 baspar med en Covaris S2 instrument (duty cycle 5, intensitet 5, cykler / brista 200, tid 60 sek under 4 cykler) . Att reparera klippt DNA ändar, lägg 14 l 10x ligation buffert, 14 l 2,5 mM dNTP mix, 5 l T4 DNA-polymeras, 5 l T4 polynucleotide kinas, 1 l Klenow DNA-polymeras och 1 l vatten. Inkubera i 30 minuter i rumstemperatur. Efter inkubation, använd en Qiagen MinElute kolumn för att rena DNA enligt tillverkarens rekommendationer. Eluera DNA två gånger med 15 l 1x Tris-Low-EDTA (TLE: 10 mM Tris pH 8,0, 0,1 mM EDTA). Sedan bifoga en dATP till 3 "ändar i slutet reparerade-DNA genom att lägga till 5 l 10x NEBuffer2, 10 l 1 mM dATP, 2 l vatten och 3 l Klenow (exo-). Inkubera reaktionen i 30 minuter vid 37 ° C. För att inaktivera Klenow fragment, inkubera de reaktioner i 20 minuter vid 65 ° C och därefter sval reaktionerna på is. Med hjälp av en speedvac, minska reaktionsvolym till 20 l. Därefter laddar DNA i en 1,5% agarosgel med 1X TAE och köra i 3,5 timmar vid 80-90V. Efter färgning av gelen med SYBR grön, visualisera DNA på en DarkReader. Punktskatter DNA-fragment mellan 300 och 500 par bas och rena dem med en Qiagen gel utvinning kit med 2-4 kolumner beroende på vikten av gelen. Eluera DNA med 50 l 1x TLE. Kombinera eluat från Qiaquick kolumner och få den slutliga volymen upp till 300 l med 1x TLE. Slutligen bestämma DNA-koncentration med Quant-IT-analysen med qubit fluorometer och beräkna den totala mängden DNA. III. Biotin pull-down och parade slut Sequencing I detta avsnitt i protokollet, är ligation korsningar renas från DNA poolen, vilket möjliggör effektiv identifiering av interagerande kromatin fragment av parade slut sekvensering. Utför alla efterföljande steg i rören DNA LoBind. Förbered pärlor för biotin pull-down genom att tvätta 150 l återsuspenderad magnetiska streptavidin pärlor två gånger med 400 l Tween buffert (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,05% Tween). Dessa och kommande tvättar består av fem steg: Lägg buffert för att kulorna Överför blandningen till ett nytt rör Rotera provet i 3 minuter vid rumstemperatur Reclaim kulorna med hjälp av en magnetisk partikel koncentrator Avlägsna supernatanten Resuspendera pärlor i 300 l 2x Nej Tween buffert (2x NTB: 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 2 M NaCl) och kombinera med 300 l Hi-C-DNA. Låt biotin märkt Hi-C-DNA för att binda till streptavidin pärlor genom inkubering av blandningen i rumstemperatur i 15 minuter med rotation. Reclaim DNA bunden streptavidin pärlor med den magnetiska partiklar concentrratör och avlägsna supernatanten. Tvätta pärlor i 400 l 1x NTB (5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl), följt av 100 l 1x ligering buffert. Resuspendera pärlor i 50 l 1x ligation buffert och överför blandningen till ett nytt rör. För att förbereda DNA för Illumina Paired End-sekvensering, ta den totala mängden DNA som används som input för biotin pull-down, som beräknades tidigare i steg 2,6, och dela det med 20 för att uppskatta mängden Hi-C-DNA som har dragits ner och finns tillgänglig för ligatur. Tillsätt 6 picomoles av Illumina Paired End-adaptrar per mikrogram av Hi-C DNA tillgängliga för ligatur. Använd 1200 enheter T4 DNA-ligas för att ligate adaptrarna till DNA. Inkubera 2 timmar vid rumstemperatur. Ta bort icke-knyts ihop Paired End-adaptrar som återvinna Hi-C-DNA bunden pärlor och tvätta pärlor två gånger med 400 l 1x TB. Tvätta pärlor med 200 l 1x NTB, följt av 200 l och 50 l 1x NEBuffer 2. Efter den sista tvättningen, resuspendera pärlor i 50 l 1x NEBuffer 2 och förflyttas till en ny tub. För att fastställa antalet cykler som krävs för att generera tillräckligt med PCR-produkt för sekvensering, inrätta fyra testa PCR-reaktioner med 6, 9, 12 eller 15 cykler. (För mer information om PCR-amplifiering, se: 12 fastställa den optimala cykeln numret genom att köra PCR-reaktioner på en 5% polyakrylamidgel och färgning med Sybr Green, garanterar frånvaron av falska band och närvaron av ett utstryk mellan 400 -. 600 baspar, vilket är längden på klippt produkter efter ligering med adaptrarna. Förstärk resten av Hi-C-bibliotek-bundet streptavidin pärlor i en storskalig PCR med det optimala antalet PCR-cykler. Pool PCR-produkter från olika brunnar och återta pärlor. Håll 1% av den storskaliga PCR-produkten separat för att köras på en gel och rena resten av PCR-produkten med 1,8 x volym Ampure pärlor enligt tillverkarens rekommendationer. Eluera DNA med 50 l 1x TLE buffert och jämföra 1% av Ampure pärla renade PCR-produkten till 1% delprov av ursprungliga PCR-produkten på en 5% polyakrylamidgel, se till att få bort av PCR-primers. Vi rekommenderar också kloning 1 ìl av Hi-C-biblioteket och bestämma produkten av ca 100 kloner med Sanger-sekvensering. Detta ger dig möjlighet att bedöma det relativa antalet alignable Hi-C läser i PCR-blandningen. För typiska resultat, se figur 3B. Sekvens Hi-C-bibliotek med Illumina parade slutet sekvensering. Passa in varje ände självständigt med MAQ (http://maq.sourceforge.net/) för att identifiera samverkande kromatin fragment. IV. Representant Hi-C Resultat Följande resultat förväntas då Hi-C-protokollet körs tekniskt väl och kan betraktas som standarderna för kvalitetskontroll. Kvalitetskontroll steg bör avslöja att både 3C och Hi-C-bibliotek drivs som ganska tight band större än 10 kb. En DNA-smear indikerar dålig ligering effektivitet. Normalt är ligation verkningsgrad något lägre i ett Hi-C-biblioteket jämfört med ett 3C mall (se Figur 2A). Hi-C-märkning och ligation effektivitet kan uppskattas genom nedbrytning av en PCR-produkt som genererats med 3C grundfärger. 3C korsningar skärs av HindIII och inte av NheI. Det omvända gäller för Hi-C korsningar. Denna PCR smälta analys visar att 70% av Hi-C amplicons skärs av NheI och inte av HindIII, bekräftar effektiv märkning av ligation korsningar (se figur 2B). Analys av sekvenserade läser ska visa som läser från både intrachromosomal och interchromosomal interaktioner, vilket indikeras av den blå och röda linjer, anpassa betydligt närmare HindIII begränsning platser jämfört med slumpmässigt genererade läser, visas i grönt (se figur 3A). I ett lyckat experiment, 55% av de läste alignable paren representerar interchromosomal interaktioner. Femton procent representerar intrachromosomal interaktioner mellan fragment mindre än 20 kb isär och 30% är intrachromosomal läser par som är mer än 20 kb mellanrum (se figur 3B). Denna fördelning kan vara provtagning före till hög kapacitet sekvensering, som en form av kvalitetskontroll, kloning och Sanger-sekvensering av ca 100 kloner är vanligen tillräcklig. Den kromatin interaktioner kan visualiseras som en heatmap, där x-och y-axeln representerar loci i genomet ordning och varje pixel representerar antalet observerade interaktioner mellan dem. Vanligtvis kommer DNA-fragment som är mycket nära varandra i den linjära arvsmassan har en tendens att interagera ofta med varandra. Detta syns i intrachromosomal heatmaps som en framstående diagonal (se figur 4A). Följande resultat visar olika sätt att analysera uppgifterna för att avslöja olika nivåer i genomet organisation. Plottning kontakten probability kontra genomisk avstånd (se figur 5a) visar att sannolikheten för kontakt minskar som en funktion av genomisk avstånd, så småningom når en platå. Vid varje distans, är intrachromosomal interaktioner, som visas i den heldragna linjen, berikad förhållande till interchromosomal interaktioner, företrädd av de streckade linjerna. Detta innebär direkt närvaro av kromosom territorier. Beräkna den observerade / förväntade antalet interchromosomal kontakter mellan alla par av kromosomer avslöjar förmånliga samband mellan viss kromosom par. Små gen-rika kromosomer interagerar företrädesvis med varandra, indikeras med klarröd färg (se figur 5B). Individuella kromosomer kan också undersökas. Den råa heatmap kan justeras med en förväntad heatmap redogöra för genomisk avståndet mellan par av loci, vilket resulterar i en observerad / förväntas heatmap. Sedan kan en korrelationsmatris tas fram genom att korrelera de rader och kolumner av de observerade / förväntas heatmaps. Använda korrelationsanalys, är det visat att det mänskliga genomet segregerar i två fack. Detta illustreras av den rutiga-mönstret i samband heatmaps (Se figur 4A-D). (För mer information om Hi-C dataanalys, se: 1. Använda Hi-C data var nya insikter i kromatin vika vid megabase skala. Den klassiska modellen av polymer kondens tyder på att kromatin förpackningar till en jämvikt globule. Plottning kontakt sannolikheten som funktion av avstånd visar att skalorna kontakt sannolikheten som en makt lag med genomisk avståndet vars lutning är cirka -1 (se figur 6A). Detta är inte förenligt med beteendet hos en jämvikt globule, men stämmer förväntningar på en alternativ struktur som kallas fraktal globule (se figur 6B). Här är två klotformiga strukturer visas. Färg motsvarar avståndet från en endpoint, från blått till cyan, grön, gul, orange och rött (se figur 6C överst). Till skillnad från jämvikt globules, fraktal globules brist förvecklingar. I en fraktal globule, loci som ligger i närheten längs konturen tenderar att vara i närheten i 3D, vilket leder till förekomsten av monokromatisk block (se figur 6C mitten). Sådana block finns inte i jämvikt globule (se figur 6C botten). Figur 1. Hi-C översikt. Celler är tvärbunden med formaldehyd, vilket resulterar i kovalenta länkar mellan rumsligt närliggande kromatin segment (DNA-fragment: mörkblå, röd, proteiner, som kan förmedla sådana interaktioner, visas i ljusblått och cyan). Kromatin kokas tillsammans med en begränsning enzym (här HindIII, begränsning sajt: streckad linje, se infälld). Den resulterande klibbiga slutar fylls i med nukleotider, varav en är biotinylerad (lila prick). Ligatur utförs under extremt utspädda förhållanden gynnar intramolekylära ligation händelser, det HindIII webbplats är förlorat och en NheI plats skapas (infälld). DNA renas och klippt och biotinylerad korsningar är isolerade med streptavidin pärlor. Samverkande fragment identifieras av parade slut sekvensering. Figur 2. Hi-C-bibliotek kvalitetskontroller. (A) Ökande mängder av ett 3C kontroll och en Hi-C-bibliotek löstes på en 0,8% agarosgel. Båda biblioteken drivs som en ganska tight band större än 10 kb. Typiska ligatur effektivitet i ett Hi-C-biblioteket är något lägre än vad som observerats i ett 3C mall och indikeras med cellprov i Hi-C körfält. (B) PCR smälta kontroll. En ligatur trafikplats utgörs av två närliggande fragment förstärks med standard 3C PCR-förhållanden. Hi-C ligation produkter kan särskiljas från dem som produceras i konventionella 3C bearbetning av ligering sajten. Hi-C-korsningar skärs av NheI, inte HindIII, det omvända gäller för 3C korsningar. 70% av Hi-C amplicons sänktes med NheI, bekräftar effektiv märkning av ligering korsning. Två replikat gjordes för att säkerställa tillförlitlig kvantifiering. Figur 3. Hi-C läser kvalitetskontroller. (A) Läser från fragment motsvarande både intrachromosomal (blå) och interchromosomal (röd) interaktioner anpassa betydligt närmare HindIII begränsning platser jämfört med slumpmässigt genererade läsningar (grön). Både intrachromosomal läser och interchromosomal läser kurvor minskar snabbt när avståndet från HindIII webbplatsen ökar tills en platå nås på ett avstånd av ~ 500 BP. Detta motsvarar den maximala fragment storlek används för sekvensering. (B) Normalt 55% av de läste alignable paren representerar interchromosomal interaktioner. Femton procent representerar intrachromosomal interaktioner mellan fragment mindre än 20 kbisär och 30% är intrachromosomal läser par som är mer än 20 kb isär. Denna fördelning kan vara provtagning före till hög kapacitet sekvensering, som en form av kvalitetskontroll, kloning och Sanger-sekvensering av ca 100 kloner är vanligen tillräcklig. Figur 4. Korrelationsanalys visar att kärnan är uppdelade i två fack. (A) heatmap motsvarande intrachromosomal interaktioner på kromosom 14. Varje pixel representerar alla interaktioner mellan en 1-Mb lokus och en annan 1-Mb locus, intensitet motsvarar det totala antalet läsningar (intervall: 0-200 läsningar). Skalstreck visas varje 10 Mb. Den heatmap uppvisar underbyggnad i form av en intensiv diagonal och en konstellation av stora block. (Kromosom 14 är acrocentric,. Den korta armen visas inte) Använda Hi-C datasetet för att beräkna den genomsnittliga kontakta sannolikheten för ett par loci vid en viss genomisk avstånd, är en förväntan matris produceras (B), motsvarande vad som skulle vara iakttagits om det inte fanns några långsiktiga strukturer. Kvoten av dessa två matriser är ett observerat / förväntat matris (C) där utarmning visas i blått och anrikning i rött [intervall: 0,2 (blå) till 5 (röd)]. Blocket Mönstret blir tydligare. Den korrelationsmatris (D) visar korrelationen [område: -1 (blå) till 1 (röd)] mellan intrachromosomal Interaktionsprofilerna av varje par av loci längs kromosom 14. Den slående rutigt mönster indikerar förekomst av två fack i kromosom. Figur 5. Förekomst och organisation av kromosom territorier. (A) Sannolikheten för kontakt minskar som en funktion av genomisk avstånd på kromosom 1, så småningom når en platå på ~ 90 MB (blå). Nivån på interchromosomal kontakt (svarta streck) skiljer sig för olika kromosompar, lokus på kromosom 1 är mest benägna att interagera med lokus på kromosom 10 (grön streck) och minst benägna att interagera med lokus på kromosom 21 (röda streck). Interchromosomal interaktioner är utfiskade förhållande till intrachromosomal interaktioner. (B) Observerat / förväntade antalet interchromosomal kontakter mellan alla par av kromosomer. Rött indikerar anrikning och blått indikerar utarmning [intervall: 0,5 (blå) till 2 (röd)]. Små, gen-rika kromosomer tenderar att interagera mer med varandra. Figur 6. Lokala förpackning av kromatin är förenlig med beteendet hos en fraktal globule. (A) Kontakt sannolikheten som en funktion av genomisk avstånd, i genomsnitt över hela arvsmassan (blå). En framstående strömmen lag skalning ses mellan 500KB och 7Mb (skuggade området) med en lutning på -1,08 (passar visas i cyan). (B) Simulering resultat för kontakt sannolikheten som funktion av avstånd för jämvikt (röd) och fraktala (blå) fettkulor. Lutningen för en fraktal globule är mycket nära -1 (cyan), vilket bekräftar vår nya teoretiska förutsägelse 1. Lutningen för en jämvikt globule är -3 / 2, vilket motsvarar tidigare teoretiska förväntningar. Lutningen för fraktal globule liknar den lutningen som observerats i Hi-C-resultat, medan lutningen för en jämvikt globule inte syns i Hi-C data. (C) Top: En ovikt polymerkedja, 4000 monomerer lång. Färg motsvarar avståndet från en endpoint, från blått till cyan, grönt, gult, orange och rött Mitten:. Typiska exempel på en fraktal globule hämtade från vår ensemble. Fractal globules saknar förvecklingar. Loci som ligger i närheten längs konturen tenderar att vara i närheten i 3D, vilket leder till förekomsten av stora enfärgade block som är synliga på ytan och i tvärsnitt Botten:. En jämvikt globule. Strukturen är mycket intrasslad, loci som ligger i närheten längs konturen (liknande färg) behöver inte vara i närheten i 3D.